人Era蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其純化

1、人Era蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá)及其純化 作者：吳元明，陳蘇民，陳南春，紀(jì)宗玲，劉惠萍，張俊杰【關(guān)鍵詞】 人Era基因關(guān)鍵詞: 人Era基因;基因表達(dá);蛋白純化 摘 要:目的 在大腸桿菌中對人的era基因（簡稱hera）進行表達(dá)、純化. 方法 PCR擴增hera基因，測序正確后克隆入大腸桿菌融合表達(dá)載體pRSET-C，重組質(zhì)粒pRSETC-hera以大腸桿菌BL21（DE3）為宿主菌，用IPTG進行誘導(dǎo)表達(dá).然后利用親和層析的方法對表達(dá)蛋白進行純化. 結(jié)果 克隆了hera基因，測序正確;利用pRSET-C載體在大腸桿菌中融合表達(dá)了全長hera-cDNA基因，表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的59.6%.融

2、合蛋白在菌體內(nèi)主要以包涵體形式存在，在變性條件下用Ni-NTA親和色譜柱純化此融合蛋白，其純度達(dá)到了98.0%. 結(jié)論 利用基因重組技術(shù)在大腸桿菌中高表達(dá)了hera基因.并對融合蛋白進行了初步純化. Keywords:human Era gene;gene expression;protein purifi-cation 1 / 14Abstract:AIM To express human Era protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS After being amplified by PCR and identified

3、by sequencing the human era gene was in-serted into expression vector pRSET-C.The recombinant plasmid pRSETC-hera was transformed into BL21（DE3）andinduced with IPTG.The expressed protein was purified by affinity chromotography.RESULTS The human era gene was amplified and the sequence proved to be co

4、rrect.The hera-cDNA gene had been cloned into the vector and ex-pressed in E.coli，and the expressed protein took59.6%of the total bacterial protein.The fused protein existed in the pattern of inclusion body，and it was purified on denatured condition by using Ni-NTA affinity chromotography column.CON

5、CLUSION The hera gene could be expressed with high efficiency in E.coli by using gene recombination technique.The fused protein is purified preliminarily. 0 引言 era基因是1986年在測定大腸桿菌基因組序列時，在編碼RNaseIII的rnc基因下游發(fā)現(xiàn)的一個開放讀框，因其編碼的氨基酸序列與人及酵母的Ras蛋白有部分相似之處，命名為E.coli Ras-like（era）基因1 .era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕蟲、小鼠、人

6、、植物中也存在與細(xì)菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成員.它由兩個結(jié)構(gòu)域組成:N端是一個典型的GTPase結(jié)構(gòu)域;C端結(jié)構(gòu)域為Era所特有，其中含有一個KH結(jié)構(gòu)域2 .在大腸桿菌中era基因和rnc基因同屬于rnc操縱元，rnc基因和era基因的表達(dá)共同受RNaseIII的負(fù)調(diào)控3 .era是大腸桿菌中可以正常表達(dá)的基因，但表達(dá)水平極低.遺傳學(xué)實驗證實era基因與細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂有關(guān)，是細(xì)菌生存繁殖所必需的重要基因 4 .高表達(dá)的細(xì)菌Era蛋白有GTP結(jié)合及GTPase活性5 .最近發(fā)現(xiàn)細(xì)菌Era蛋白可以特異地與16S-rRNA結(jié)合6 . 本室陳蘇民教授通過計算機尋索，發(fā)現(xiàn)

7、從線蟲、小鼠到人都有與細(xì)菌era同源的EST序列，并且相繼克隆了人及小鼠全長的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全長約2.2kb，含長度為1038bp的開放讀框，編碼346氨基酸的蛋白質(zhì)7 .人Era（hEra）與大腸桿菌Era（eEra）蛋白全序列比較，有31.0%相同、53.0%相似.同樣，hEra也是由N端的GTPase結(jié)構(gòu)域和C端KH結(jié)構(gòu)域所構(gòu)成8 .新近克隆的人及小鼠era基因為整個era基因家族的功能研究提供了重要的資料.本研究目的是將hera基因在大腸桿菌中進行高表達(dá)、純化.這為進一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基礎(chǔ). 1 材料和方法 1.1 材料 大腸桿菌BL2

8、1（DE3）菌種購自Promega公司.pUC19質(zhì)粒均為本教研室保存;表達(dá)質(zhì)粒pRSET-C為Invitrogen公司產(chǎn)品.pBS-hera為陳蘇民教授提供.各種限制性內(nèi)切酶、連接酶、核酸修飾酶及Taq酶均為Gibco公司產(chǎn)品.DNA marker和蛋白marker為Takara公司產(chǎn)品.柱式質(zhì)粒純化試劑盒為華舜公司產(chǎn)品.NucleoTrap Gel Extraction試劑盒購于CLONTECH公司.Ni-NTA spin kit為QIAGEN公司產(chǎn)品. 1.2 方法 1.2.1 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物的鑒定 PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG，反向

9、:5'-AA-CTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC.PCR反應(yīng)以pBS-hera為模板在PE公司9600反應(yīng)儀上進行.PCR反應(yīng)條件為:9630s，5545s，7260s，30個循環(huán).純化的PCR產(chǎn)物用BamHI和PstI雙酶切定向克隆入pUC19質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，進行藍(lán)白篩選，并經(jīng)酶切鑒定篩選出含插入片段的陽性克隆.重組的pUC19質(zhì)粒經(jīng)提取純化后，以此作為測序模板，在PE公司310型測序儀上進行核苷酸序列分析. 1.2.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建 從重組的pUC19質(zhì)粒上用BamHI和PstI切下目的片段，再用BamHI和PstI雙酶切pRSET-C載體.

10、目的片段與載體片段均用NucleoTrap Gel Extraction試劑盒從瓊脂糖凝膠內(nèi)回收.然后進行DNA的連接，將DNA連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，用氨芐抗性進行篩選，經(jīng)酶切鑒定出含插入片段的陽性克隆. 1.2.3 蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 挑取pRSETC-hera重組表達(dá)菌株，接種于5mL含Amp的2xYT培養(yǎng)基（胰蛋白胨16g L-1 ，酵母提取物10g L-1 ，NaCl5g L-1 ），37培養(yǎng)過夜，次日按4.0%轉(zhuǎn)接于含Amp的2xYT培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)3h，加入IPTG至終濃度1mmol L-1 誘導(dǎo)表達(dá)，37振蕩培養(yǎng)27h.取菌體，做120g L-1 SDS-

11、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）. 1.2.4 SDS-PAGE 49000g離心5min收集菌體，用含3mL L -1 巰基乙醇加樣緩沖液處理（100， 10min），12000g離心10min，采用Laemmli不連續(xù)PAGE，150g L-1 分離膠，考馬斯亮藍(lán)R-250染色. 1.2.5 蛋白質(zhì)的純化 離心收集100mL誘導(dǎo)菌液的菌體，按每克濕菌體10mL加入超聲緩沖液（0.05mol L-1 NaH2 PO4 ，0.3mol L-1 NaCl）懸浮，-20凍融2次，再加入溶菌酶至1g L-1 ，室溫放置30min，然后超聲裂解（150W，每次1min，共5次），4下12000g

12、離心20min.再加入超聲緩沖液10mL懸浮包涵體，4下12000g離心20min，收集包涵體沉淀.用5mL緩沖液B（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris Cl，pH8.0）懸浮包涵體，Vortex，室溫放置2h，4下12000g離心15min，取上清，4下12000g再離心15min，留上清上Ni-NTA親和色譜柱.先用緩沖液B預(yù)平衡Ni-NTA柱，上樣，用緩沖液C（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH6.3）洗滌，接著用緩沖液D（8mol L-1 尿素，

13、100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH5.9）洗滌，再用緩沖液D1（緩沖液C，250mmol L-1 咪唑）洗脫，用緩沖液E（8mol L-1 尿素，100mmol L1 NaH 2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH4.5）灌洗.在280nm監(jiān)測下，收集每個吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE. 2 結(jié)果 2.1 hera基因的擴增 以pBS-hera質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴增獲得hera基因片段，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%AGE，與編碼hEra全長的cDNA（1038bp）大小相符（Fig1）.將全長hera基因片段克隆入

14、pUC19質(zhì)粒，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5感受態(tài)細(xì)胞，從培養(yǎng)板上隨機挑選白色克隆，從中提取質(zhì)粒，用BamHI和PstI雙酶切鑒定，含有插入片段的重組質(zhì)粒命名為pUC19-hera.酶切鑒定結(jié)果見Fig2.提取重組質(zhì)粒pUC19-hera，以pUC19通用測序引物進行核苷酸序列測定.測序結(jié)果表明，所擴增的hera基因與已知序列完全相符.2.2 pRSETChera表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和誘導(dǎo)表達(dá) 將hera-cDNA基因全長從pUC19-hera亞克隆到表達(dá)載體pRSET-C中，經(jīng)酶切鑒定，將重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pRSETC-hera.酶切鑒定結(jié)果見Fig3.將pRSETC-hera質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受

15、態(tài)細(xì)胞，在2xYT培養(yǎng)基中生長，轉(zhuǎn)接后用IPTG誘導(dǎo)4h，由120g L-1 SDS-PAGE結(jié)果可見:與未誘導(dǎo)的對照菌相比誘導(dǎo)菌在Mr 42×103 處有明顯的新蛋白表達(dá)帶出現(xiàn)，大小和預(yù)期的6His-hEra融合蛋白相符（Fig4），激光薄層掃描結(jié)果表明此表達(dá)條帶占菌體總蛋白的59.6%.表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在.2.3 6HishEra融合蛋白的純化 收集100mL誘導(dǎo)菌液的菌體，經(jīng)裂菌、離心、洗滌、再離心后獲得包 涵體沉淀.包涵體被變性溶解后上Ni-NTA柱，用緩沖液C，D洗滌，用含咪唑的緩沖液D1洗脫，再用緩沖液E灌洗.在280nm監(jiān)測下，觀察蛋白的流出情況.收集每個吸

16、收峰并行120g L-1 SDS-PAGE（Fig5）.激光薄層掃描結(jié)果表明，用Ni-NTA親和色譜柱純化此融合蛋白的純度達(dá)到了98.0%. 3 討論 我們利用基因工程的手段在pRSET-C載體內(nèi)高表達(dá)了hEra蛋白.pRSET-C是一個受PT7 強啟動子驅(qū)動下的融合表達(dá)載體，因而易于在原核進行的目的基因高表達(dá).另外，在目的基因的5'端融合了6個組氨酸的純化標(biāo)簽，可以用金屬螯合親和層析來分離純化表達(dá)的融合蛋白.組氨酸與金屬離子的結(jié)合與蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)無關(guān)，因此表達(dá)的融合蛋白就可以在變性條件下得到純化，然后復(fù)性，這就避免了復(fù)性后的蛋白質(zhì)由于純化條件的改變而丟失. 不同的培養(yǎng)條件對外源基因

17、的表達(dá)效率也有一定的影響.含pRSETC-hera質(zhì)粒的BL21（DE3）菌在LB培養(yǎng)基中IPTG誘導(dǎo)6His-hEra融合蛋白表達(dá)時，表達(dá)產(chǎn)物占菌體總蛋白的30.0%;當(dāng)改用2xYT培養(yǎng)基時，外源基因的表達(dá)效率明顯提高，表達(dá)產(chǎn)物達(dá)菌體總蛋白的59.6%.在不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，表達(dá)產(chǎn)物均以包涵體形式存在.我們先對包涵體進行了分離、洗滌和純化.然后用金屬親和層析的方法對其進行了進一步的純化、復(fù)性.當(dāng)pH6.3時，融合了6個組氨酸的蛋白質(zhì)能和螯合了Ni2+ 的金屬親和層析柱相結(jié)合;而當(dāng)pH=5.9或在咪唑存在的情況下，融合蛋白不再與Ni2+ 結(jié)合而被洗脫下來.我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，用含咪唑的洗脫液進

18、行洗脫的方法要好于通過降低pH值進行洗脫的方法.首先降低pH值不能將融合蛋白洗脫干凈，我們用pH=5.9的洗脫液進行洗脫時（Fig5），就不能將融合蛋白洗脫下來.另外，結(jié)合緩沖液的pH值與洗脫緩沖液的pH值相差僅0.4，溶液的pH值又易受環(huán)境的影響，因此在每次實驗前需精心調(diào)試，給實際操作帶來諸多不便. 隨著基因組計劃的進展，許多生物的基因組序列測定工作已經(jīng)或即將完成.但是序列測定后，基因的功能及其表達(dá)調(diào)控的研究將成為后基因組時代最重要的任務(wù).era基因是一個從細(xì)菌到人高度保守的小G蛋白基因.以前era基因的功能研究都局限于原核生物，難以揭示整個era基因的功能.本研究為era基因在真核生物的功

19、能研究打下了基礎(chǔ). 參考文獻: 1Ahnn J，March PE，Takiff HE，Inouye M.A GTP-binding pro-tein of Escherichia coli has homology to yeast RAS proteins J.Proc Natl Acad Sci USA，1986;83（3）:8849-8853. 2Chen X，Court DL，Ji X.Crystal structure of ERA:A GTPase-dependent cell cycle regulator containing an RNA binding motif J.Pr

20、oc Natl Acad Sci USA，1999;96（2）:8396-8401. 3Chen SM，Court DL.Coexpression of era with rnc gene in Es-cherichia coli J.Shengwu Huaxue Zazhi（Chin Biochem J），1991;7（5）:518-524. 4Britton RA，Powell BS，Dasgupta S，Sun Q，Margolin W，Lup-ski JR，Court DL.Cell cycle arrest in Era GTPase mutants:A potential growth rate regulated cell cycle checkpoint in Es-cherichia coli J.Mol Microbiol，1998;27（13）:739-775. 5Chen SM，Court DL.Purification and some biochemical proper-ties of soluble Era