大腸桿菌檢測方法

1、大腸菌群及檢驗(yàn)、大腸菌群介紹大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37 C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。大腸菌群分布較廣， 在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。 調(diào)查研究表明，大腸菌群細(xì)菌 多存在于溫血動物糞便、人類經(jīng)?；顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。 糞便中多以典型大腸桿菌為主， 而外界環(huán)境

2、 中則以大腸菌群其他型別較多。大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低， 表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物， 其中有健康人糞便， 也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險(xiǎn)性。大腸菌群是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。二、大腸菌群檢驗(yàn)方法：由于大腸菌群

3、指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即:需氧及兼性厭氧、在37 C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照 它的定義進(jìn)行。目前國內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測程序上略有不同。(一)國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培 養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36 土 C培養(yǎng)48i2h,觀察是否產(chǎn)氣。分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36蟲C培養(yǎng)18-24h,觀察菌落形態(tài)。證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落

4、， 進(jìn)行革蘭氏染色觀察。 同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管 36±1C 培養(yǎng)24±2h,觀察產(chǎn)氣情況。報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查 MPN表，報(bào)告每100ml (g)大腸菌群的MPN 值。具體操作參見 GB4789.3-94 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定(二)原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測。本方法采用兩步法：推測試驗(yàn)：樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。36±1C培養(yǎng)48+2h,觀察是否產(chǎn)氣。證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB )肉湯管中，3

5、6±1C培養(yǎng)48+2h,觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性。查MPN表，報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的 MPN值。具體操作參見 SN0169-92 中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法三、說明：1. MPN檢索表：MPN為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn) 行稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)， 從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。注意國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附MPN表所用

6、稀釋度是不同的， 而且結(jié)果報(bào)告單位也 不相同。2. 初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：無論是國家標(biāo)準(zhǔn)的三步法還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即在37 C分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌， 經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后， 有時(shí)可能成為陰性。 有 數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率， 初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。 因此，在實(shí)際 檢測工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。3. 產(chǎn)氣量與倒管：在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣

7、泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體， 少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。 如果對產(chǎn) 酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)， 可以用手輕輕打動試管， 如有氣泡沿管壁上浮， 即應(yīng)考 慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。4. 挑選菌落：國家標(biāo)準(zhǔn)中，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離，對典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn)。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān)。國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基， 在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時(shí)，檢出率最高; 紅色、粉紅色菌落檢出率較低。另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系，只挑取一個(gè)菌落，由于機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí)， 很難避免假陰性的出現(xiàn)。 所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè)，以免出現(xiàn)假陰性。5.抑菌劑：大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀 綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。國家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯