海馬細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

1、3.1海馬原代培養(yǎng)操作準(zhǔn)備：1、 取海馬：培養(yǎng)皿6個（3對），D-hanks（100ml，提前預(yù)冷），75%酒精，眼科鑷2把，小剪刀3把，小鑷子4把（三個彎頭，一個直頭），冰袋3個，中號鑷一把。2、 細(xì)胞室：小dish，多聚賴氨酸（1個EP），紙抽，細(xì)胞剪，胰酶（2個EP），DMEM（10%胎牛血清+青霉素+鏈霉素，提前拿出），離心管2個，24孔板1個，細(xì)胞篩2個，廢液缸1個, D-hanks3、 分裝：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、鏈霉素：500ul、胎牛血清：10ml、DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml4、玻璃器皿：移液管

2、，培養(yǎng)皿，24孔板內(nèi)的玻璃片，泡酸過夜，自來水清洗10遍，一蒸10遍，三蒸3遍，烤干，高壓，再烤干步驟：1、 培養(yǎng)前30min包被多聚賴氨酸置于培養(yǎng)箱中備用；2、75%酒精浸泡鼠，斷頭取腦（1把中鑷，1把中剪）3、剝離海馬（D-hanks液，冰盒，4把小鑷）4、去血管、被膜（顯微鑷2把） （進(jìn)細(xì)胞間）5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml離心管6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次7、15-20 min，37，期間5min震蕩一次8、1:1比例加（DMEM+青鏈+胎牛血清）終止消化，吹打20次9、配平，1000rpm，5min10、棄上清，得沉淀11、加（DMEM+青鏈+胎牛血清

3、），吹打20次12、100目過篩，13、放入15ml離心管，吹打14、配平，1000rpm，5min15、棄上清，得沉淀，加DMEM，吹打16、200目過篩17、計數(shù)（1×106）18、500微升/孔（24孔板）19、24孔板放入恒溫培養(yǎng)箱中，37，5%CO220、第二天換Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul）21、隔三天換液 注意事項：1、取海馬的操作過程要迅速，提高神經(jīng)細(xì)胞的存活率。 2、從斷頭處死鼠到胰酶消化前整個過程都要在冰上進(jìn)行。 3、如果是胎鼠，不要取一個分離一個，而是要快速把所有胎鼠大腦都迅速取出放到預(yù)冷的液體中。 4、一定要盡可能的去掉所有的

4、血管和血管膜。5、吹打動作要輕柔，以免損傷細(xì)胞。 6、種板時密度很重要，過密和過稀都會影響細(xì)胞生長。 7、種板后需輕搖晃板，切記！不能圈圈搖晃。應(yīng)左右平行，上下平行搖晃。3.2 海馬細(xì)胞的鑒定：取培養(yǎng)7-9天的細(xì)胞海馬神經(jīng)細(xì)胞特異性抗體：神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、微管相關(guān)蛋白質(zhì)2（MAP2）、生長相關(guān)換蛋白43（GAP-43）NSE：神經(jīng)元特異性烯醇化酶，血清NSE是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞所特有的一種酸性蛋白酶GAP-43：GAP-43是一種膜相關(guān)的鱗蛋白，與神經(jīng)纖維生長的調(diào)節(jié)有關(guān)，主要分布于海馬神經(jīng)元的軸突MAP2：MAP2是一種細(xì)胞骨架蛋白，定位于海馬神經(jīng)元的胞體和樹突。方法:辣根過

5、氧化物酶標(biāo)記SABC法（NSE，1:100）， FITC標(biāo)記免疫熒光法（MAP2，1:100;GAP-43,1:250）。鑒定標(biāo)準(zhǔn):NSE的DAB顯色結(jié)果：NSE免疫陽性反應(yīng)物呈棕黃色顆粒，主要分布在神經(jīng)細(xì)胞的胞漿及部分較粗大的突起中，膠質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞不著色，陰性對照細(xì)胞未件著色?；瘜W(xué)染色顯示海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)均勻，體積相似，胞體飽滿，呈橢圓形或多邊形。GAP-43的熒光顯色結(jié)果：陽性反應(yīng)物呈明亮的綠色熒光，反應(yīng)物主要分布在胞體和粗大的軸突，樹突無染色，膠質(zhì)細(xì)胞無染色。染色顯示培養(yǎng)一周左右的海馬神經(jīng)元胞體飽滿，呈橢圓形，軸突粗大發(fā)達(dá)。MAP2熒光顯色結(jié)果：陽性反應(yīng)物呈綠色銀光，反應(yīng)物分布于神經(jīng)元的胞

6、體和樹突，軸突及膠質(zhì)細(xì)胞均不染色。染色顯示培養(yǎng)7、8天的海馬神經(jīng)元樹突發(fā)達(dá)，相互交錯，形成極發(fā)達(dá)的神經(jīng)纖維網(wǎng)絡(luò)。辣根過氧化物酶標(biāo)記法：戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法（常用）戊二醛交聯(lián)法操作步驟：（1）稱取HRP25mg溶于1.25戊二醛溶液中，于室溫靜置過夜。(2)反應(yīng)后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。(3)將待標(biāo)記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。(4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續(xù)攪拌3?小時。(5)加0

7、.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。(6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置41小時。(7)3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。(8)將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。過碘酸鹽氧化法操作步驟：1、稱取5mgHRP溶解于0.5ml蒸餾水當(dāng)中2、向溶液中加入0.5ml新配的0.1m的Nalo4溶液，混勻，4°C靜置30min3、加入0.16M乙二醇水溶液0

8、.5ml,混勻，靜置30min4、5mg抗體的水溶液1ml，混勻裝入透析袋，pH9.5碳酸鹽緩沖液透析，4度過夜。5、加0.2ml新配的5mg/mlNaBH4液，混勻，再置4度，2小時。6、在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4度1小時7、3000r/min離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗兩次，最后沉淀物溶于少量0.15mol/LpH7.4的PBS中8、將上述溶液裝入透析袋中，對0.15mol/LpH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后（用萘氏試劑檢測），10000r/min離心30min去除沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，分裝后，冰凍保存。DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒 產(chǎn)品

9、編號: P0202 產(chǎn)品包裝: 共20ml 產(chǎn)品價格: 73.00元使用說明：1. 對于組織切片或細(xì)胞樣品或膜，在與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體或其它形式的探針孵育后，用適當(dāng)洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。對于檢測內(nèi)源性辣根過氧化物酶的組織或細(xì)胞樣品，在適當(dāng)固定后，也用適當(dāng)洗滌液洗滌3-5次，每次3-5分鐘。2. 按照如下比例依次加入各溶液，混勻后即配制成DAB染色工作液：DAB顯色液A0.5ml5mlDAB顯色液B0.5ml5mlDAB染色工作液1ml10ml3. 最后一次洗滌完畢后，去除洗滌液，加入適量DAB染色工作液，確保能充分覆蓋樣品。

10、4. 室溫避光孵育3-30分鐘或更長時間(可長達(dá)24小時)，直至顯色至預(yù)期深淺。5. 去除DAB染色工作液，用蒸餾水洗滌1-2次即可終止顯色反應(yīng)。6. 對于組織切片或細(xì)胞樣品，顯色反應(yīng)終止后，如有必要可以用中性紅染色液(neutral red staining   solution)染色，以便于觀察。對于膜，顯色反應(yīng)終止后，可以室溫晾干避光保存。常見問題：1. 背景顯色太深。   a. 在免疫組化時如果背景顯色太深，一方面需考慮使用適當(dāng)?shù)姆忾]液進(jìn)行封閉，例如選購適當(dāng)?shù)姆忾]液     &

11、#160;或使用和一抗相同來源的血清(10%)進(jìn)行封閉。另一方面，請注意選購經(jīng)過適當(dāng)吸附的二抗，以減小 二抗的非特異性吸附。   b. 在免疫組化時如果背景顯色太深，需注意滅活內(nèi)源性過氧化氫酶。可以在4體積甲醇中加入1體積3%過氧化氫，混勻后用于內(nèi)源性過氧化氫酶的滅活。   c. 可以考慮縮短顯色時間，或降低二抗?jié)舛?。另外，選擇適當(dāng)強(qiáng)度的洗滌液，或延長洗滌時間也會有所幫助。2. 沒有顯色或顯色太弱。   a. 可以考慮適當(dāng)提高一抗或二抗的濃度。檢測二抗效果，滴一滴稀釋二抗在膜上， 檢測二抗是否可

12、以被正常顯色。   b. 可以考慮使用更加靈敏的放大檢測體系，例如使用生物素檢測體系。   c. 可以適當(dāng)延長顯色時間，另外確定抗原修復(fù)是否對于使用的一抗是必需的。免疫組化反應(yīng)步驟:將長有海馬和皮層神經(jīng)細(xì)胞的爬片順序置入以下介質(zhì)中進(jìn)行操作:吸去培養(yǎng)液用PBS液沖洗3遍質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定15 m in;0.01mol/L PBS液中洗15 m in;（5min×3次） 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的Triton X-100 濕盒反應(yīng)40 m in;0.01mol/L PBS液中洗15 m in;（5min×3次）3%

13、H2O2孵育15min,消除內(nèi)源性的過氧化物酶0.01mol/L PBS液中洗15 m in;（5min×3次）正常山羊血清(體積比為1:100)中孵育3 h, 以消除非特異性染色; 甩掉山羊血清（不清洗）,加一抗，4度過夜或37度溫箱1-2小時 0.01 mo l/ L PBS液中洗15m in; （5min×3次）加二抗，孵育2 h; 或37度30min 0.01 mol/L PBS 液中洗15 m in; （5min×3次） SABC孵育，濕盒內(nèi)37度，20min0.01 mol/L PBS 液中洗15 m in; （5min×3次）DAB顯色，配法按說明書自來水洗5min蘇木素復(fù)染10min自來水洗5min樹膠封片若長期保存片子，可以對爬片進(jìn)行脫水處理：70%（