免疫印跡-091208

1、 Western blotting 操作規(guī)程（供參考）Western blotting(2007.7)1、 洗凈玻板，與膠接觸的一面傾斜朝下晾干。放入電泳橡膠套內卡好(有框為高;平面為低）2、 封板： （配膠全過程須戴手套和口罩，被有毒物質污染的手套必須丟棄！)1%瓊脂糖(微波加熱, 液體剛沸騰即可)全溶后用槍將電泳橡膠套底部封好（兩面）一塊膠約24ml 瓊脂糖0.5 g，加水至50ml 將其裝入電泳槽內，玻璃板高的一邊通正極（紅色鈕） 蛋白從負極向正極跑3、 分離膠：配膠（附后），一般分子量大的按10%配(or 8%)，分子量小的按12%配，10%的過硫酸銨現(xiàn)用現(xiàn)配，10%的SDS加熱溶解后

2、再用 15-20 ml/板4、 將電泳槽傾斜，將上述分離膠注入至離上樣梳約1cm，并在上面加2-3mm 高的異丙醇約500 ul/板，目的防止氧氣擴散進入凝膠而抑止聚合反應 5、 約30min后凝固，倒出異丙醇，并用去離子水沖洗10次，再用濾紙輕輕吸出殘余的水 長時間(2-3h)有利于膠結構形成，因為肉眼看膠凝時，膠內部分子的排列尚未完成6、 基層膠：基層膠的配制（附后，室溫時膠凝聚比較快，夏天約需5 min，5-6ml/板) 將剩下的基層膠放置冰水中可延緩膠凝聚 基層膠如果收縮應及時補膠7、 插上上樣梳(必需是干凈干燥的，傾斜插入以排氣泡)，注意上樣梳的下沿要距離分離膠約1cm8、 待基層膠

3、凝固后往電泳槽倒入滿電泳緩沖液一槽二槽三槽四槽五槽5×電泳緩沖液 160ml320ml480ml640ml800mlddH2O640ml1280ml1920ml2560ml3200ml9、倒入電泳液后緩慢拔出上樣梳 凝聚的膠與不凝聚的膠有不同的折光率，故可分辨 拔上樣梳后若膠齒彎曲，用9#注射針頭將其扶直10、上樣：收細胞：1、培養(yǎng)液倒入離心筒，胰酶消化細胞，也倒入離心筒，2500-3000 r/min, 10 min， 倒掉上清液2、1ml PBS重懸細胞轉移至1.5 ml EP管，2500-3000 r/min, 10 min;大槍頭吸棄上清液3、2500-3000 r/min,

4、 2-3 min , 小槍頭吸棄上清液。-80凍存 裂解： 1、每管細胞加60-100 ml裂解液，于4冰箱內冰浴1 h2、12,000 r/min離心10-15 min，用槍頭吸出上清至0.5 ml EP管3、加5×上樣緩沖液，沸水浴3-5 min。-20或-80凍存方法：每個泳道加15-20 ml的樣品(約30-100 mg，每個泳道上樣量必須一致)。 Marker(4-6 ml)加在第一個泳道或合適的泳道。（如果是新的Marker,則每瓶加200 ml 5×上樣緩沖液，分裝放于-20保存） 加的樣品不要溢出膠齒上部11、 通電：基層膠的電壓U=7585V （80V）

5、時間約0.5-1h 檢查電泳是否漏液！12、 換電壓：當跑到分離膠時，電壓調到180V， 時間約為3-4h13、 轉膜：待蛋白的前沿(溴酚藍)跑到接近膠底1cm或合適的位置時停止如果要檢測的蛋白的分子量較小，則前沿可以不太接近底部，反之，則前沿盡量接近底部1. 將膠從電泳槽中取出，首先用手術刀柄輕輕掀起玻璃板，然后用玻璃板割去基層膠。在分離膠左下部切除一角以標注凝膠的方位2. 輕輕取出分離膠，放入已配好的轉移緩沖液中3. 在轉移緩沖液中量出膠的長、寬膠在含甲醇的轉移緩沖液中會收縮2-3mm4. 剪硝酸纖維素膜（一塊膠一張）和濾紙（一塊膠6張）膜與膠形狀相等，濾紙比膠少小2-3mm，否則轉膜時易

6、短路5. 將3張濾紙和膜都泡在轉移緩沖液中，充分浸潤6. 待浸潤后，先在板上放3張濾紙，用玻棒輕推濾紙以趕走氣泡，然后輕輕放上膠，用玻棒輕推膠以趕走氣泡膠的底部（溴酚藍條帶）朝向自己、將膠反轉使膠左下角成為右下角7. 在膠上面放好硝酸纖維素膜，再放上另外3張濾紙，該過程也需要趕氣泡 膜右下角剪腳以示位置，染色后反轉即是電泳上樣順序8. 放入槽內并倒入緩沖液（膜朝里，即正極）轉移緩沖液的配制： 一槽二槽三槽一槽二槽三槽Tris Base3.64g7.28g10.92g3.36g6.73g10.08g甘氨酸17.3g 34.6g5.19g14.42g28.82g43.26g甲醇240ml 480m

7、l720ml200ml400ml600ml去離子水960ml 1920ml2880ml800ml1600ml2400mlTotal1200ml2400ml3600ml1000ml2000ml3000ml12、 采用恒流100mA 轉膜3h(大分子5h)原：轉移時電壓是25v,過夜13、 加麗春紅染色：1. 將轉膜后的聚硝酸纖維素薄膜取出，放入已配好麗春紅染色缸中，染色5min2. 待出現(xiàn)條帶后，放入去離子水中浸泡，洗去染料，并按Marker顯示的位置，按分子量大小剪成一個個條帶14、 封閉：將封閉液均勻涂在剪下的蛋白條帶上，室溫搖床緩慢振蕩封閉2h以上 封閉液；脫脂奶粉 5%（V/V）0.5g

8、1.5g2.5g0.02% 疊氮鈉0.002g0.006g0.01g1× PBS10ml30ml50ml15、 加一抗：把含一抗的封閉液滴在塑板上，將條帶從封閉液取出，濾紙貼角吸干，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，在反應體系外罩一濕潤平皿以防止溶液蒸發(fā)孵一抗通常4度過夜 通常40ul-50ul/cm2一抗溶液加入疊氮鈉，可在4存放至少2周16、 加二抗：1. 洗一抗：先用PBS洗3次，10min/次，并在搖床上振搖再用Tris-NaCl (PH 7.5)洗1次，10min/次2. 涂二抗：根據一抗的來源選擇合適的二抗，按相應的比例稀釋，室溫孵育2h二抗的配制方法： 脫脂奶粉 5

9、%（V/V）0.25g0.5gTris-NaCl(PH 7.5) 5ml10ml二抗 稀釋300-500倍17、 顯色（本方法為DAB法，現(xiàn)多用ECL法）A、二抗孵育2-3h后（室溫），用Tris-NaCl洗3次，10min/次，并振搖 B、加底物，顯色5min 底物的配制：Tris-HCl (0.01M，PH 7.6) 9ml27ml45ml二氨基聯(lián)苯胺(DAB，現(xiàn)用現(xiàn)配)6mg18mg30mg0.3%氯化鈷1ml3ml5ml總10ml30ml50ml注：臨顯色前再加入二氨基聯(lián)苯胺和CoCl2,還有30%的H2O2 10ml/10ml底物液（10ml加10mlH2O2），放入后快速顯色，一旦

10、有清晰蛋白帶出現(xiàn)立即拿出放在裝有蒸餾水的平皿中終止生色反應 蛋白分子量 （僅供參考，詳細請查閱說明書）Maker蛋 白分子量(KD)蛋 白分子量(KD)ATM236EGFR170TrkB145PLCr2140iNOS130-140SIRT1120PARP116(全長)/85/2597KDRaf76、72-76IRAK180COX-272-74COX-17066KDAkt60BECN60Caspase-855(前體)/43/42/20Cyclin B155JNK1/JNK254/46P-cdc25c55P5353Fas48 (20ug/ml)Enolase48Caspase-947(前體)/37

11、/35Actin4645KDICAD(DFF45)45/35Caspase-145(前體)/20/10ERK1/ERK242/44Caspase-7FasL38P3838IKB-a35-37P-cdc2P3434Caspase-332(前體)/17/11Bck-xl3230KDBak30FADD30BDNF30(前體)/14Bcl-226Bax23Bad23Ras21P212120KDCyto c15LC31514KDWestern blotting試劑準備1. 30%聚丙烯酰胺液： 丙烯酰胺（Acr）290 g亞甲雙丙烯酰胺（Bis）10 g加ddH2O定容至1000ml，棕色瓶4保存 神經

12、毒性，可通過皮膚吸收和呼吸道進入體內，操作時戴手套和口罩2. 4×分離膠緩沖液（1.5mol/L Tris-Hcl PH 8.8）Tris 181.71 g加ddH2O定容至1000ml ，濃鹽酸精確調至PH 8.8，4&室溫保存3. 4×濃縮膠緩沖液（0.5mol/L Tris-Hcl PH 6. 8）Tris121.14 g加ddH2O定容至1000ml，濃鹽酸精確調至PH 6. 8，4&室溫保存4. 10%SDS：電泳級SDS 10.0 g加ddH2O定容至100ml。室溫保存5. 5×電泳緩沖液 Tris15.1 g甘氨酸 94 g 10%

13、電泳級SDS50ml先在水中加入Tris堿，再加甘氨酸，最后加SDS，加水至1000ml，4保存 6. 10%過硫酸銨（AP）： AP0.1 g加ddH2O至1.0ml，-20保存，一周內使用，最好新鮮配制。7. 5×上樣緩沖液： 1mol/L Tris-Hcl (PH 6.8)0.6 ml50% 甘油 5 ml10% SDS2 ml-巰基乙醇 0.5 ml1% 溴芬藍 1 ml總10ml，置4避光保存8. TEMED：注意室溫較低時TEMED量可加倍，最后灌膠之前使用，4保存 強神經毒性，戴口罩以防止誤吸，操作時快速，存放時密封9. 轉移緩沖液：PH8.3-8.4Tris3.64

14、g甘氨酸17.3 g甲醇240 mlddH2O960 ml10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ： NaCl8.0 gKCl0.2 gNa2HPO4 12H2O1.54 gKH2PO40.2 g加ddH2O定容至1000ml，調PH7.2-7.4，室溫保存11. 封閉液； 脫脂奶粉 5%（V/V）0.5 g0.02% 疊氮鈉0.002 g1× PBS10 ml疊氮鈉毒性大，可阻斷細胞色素電子運送系統(tǒng)，操作時戴手套12.Tris-NaCl(PH7.5)Tris12.114 gNaCl17.532 g加ddH2O至2000ml,用濃鹽酸精確調至PH7.5，室溫保存13.

15、 Tris-HCl(0.01M，PH7.6)Tris1.21 g加ddH2O至1000ml,用濃鹽酸精確調至PH7.6，室溫保存14麗春紅儲備液(2%):麗春紅S2 g三氯乙酸30 g磺基水楊酸30 gddH2O100 ml麗春紅工作液(0.2%)：室溫保存2% 麗春紅儲備液一份ddH2O九份15生色液：聯(lián)苯胺顯色液（DAB）Tris-HCl (0.01M，PH7.6) 9 ml二氨基聯(lián)苯胺(DAB，現(xiàn)用現(xiàn)配)6 mg0.3%氯化鈷1 ml總10 ml以每10ml生色液加入10ul 30%的過氧化氫16細胞裂解液100ml： 50mmol/L HEPES (238.3) （pH7.4）1.19

16、15 g1%Triton-X100 1 ml100mmol/L NaF (44)440 mg1mmol/L EDTA (372.24)37.24 mg1mmol/L EGTA (380.40)38.40 mg加ddH2O定容至100ml， 4保存1M 500×正礬酸鈉(400.12)儲備液正礬酸鈉(400.12)80 mgddH2O200 ml配成儲備液-20保存裂解細胞時每ml裂解液加2ul儲備液, 正礬酸鈉終濃度為2 mmol/L0.5M（500×）儲備液PMSF(174.2)17.4 mg異丙醇200 ml配成儲備液-20保存裂解細胞時每ml裂解液加2ml儲備液, 正

17、礬酸鈉終濃度為1mmol/L使用前加入10ug/ml蛋白消化酶抑制劑aprotinin, leupeptin（儲備液500mg/ml）和pepstatinA;Aprotinin:為一58氨基堿性多肽，經反復凍融后，會發(fā)生集聚，儲存液應分裝成小份，保存于-20度，每一小份用后應予廢棄。PMSF：在溶液中不穩(wěn)定，應在臨用前從儲存液中現(xiàn)加于裂解液中。一旦眼睛或皮膚接觸了PMSF，應立即用大量的水沖洗。凡被PMSF污染的衣物應予丟棄。PMSF通常配成10mmol/L濃度儲液（1.74或17.4mg/ml溶于異丙醇中）保存于-20度。由于蛋白抑制劑可影響蛋白定量， 且新鮮的蛋白很少降解，故可不加蛋白抑制

18、劑SDS-PAGE凝膠的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）1512107.55.0線性分離范圍12-43 kDa14- kDa16-68 kDa36-94 kDa57-212 kDa蛋白質電泳應用抗體AntibodiesType of IgGDilutionBcl-2mouse monoclonal IgG1: 200Bcl-XLrabbit polyclonal IgG1: 500Baxrabbit polyclonal IgG1: 800ERK1/2rabbit polyclonal IgG1: 1000phospho-ERK1/2mouse monoclonal IgG1: 1000p38r

19、abbit polyclonal IgG1: 300phospho-p38rabbit polyclonal IgG1: 200JNK1/2rabbit polyclonal IgG1: 400phospho-JNKmouse monoclonal IgG1: 200caspse-3rabbit polyclonal IgG1: 200p53mouse monoclonal IgG1: 300phospho-p53 (ser15)rabbit polyclonal IgG1: 300PARPrabbit polyclonal IgG1: 500ICADrabbit polyclonal IgG1: 800secondary antibodygoat anti-rabbit IgG-HRP1: