分-子-生-物-學(xué)試驗(yàn)報(bào)告

1、分-子-生-物-學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2011級生物科學(xué)師范組長：組員：從甘薯中克隆ADK基因的核心片段(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)摘要：甘薯為我國農(nóng)業(yè)主要栽培作物，并且是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室常見材料，本次實(shí)驗(yàn)主要 以甘薯葉片(部分為莖)為實(shí)驗(yàn)材料，第一次實(shí)驗(yàn)從材料中提取 RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈， 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大量ADK基因核心片段，電泳檢測膠回收 ADK基因核心片段，將其與T載 體相連并導(dǎo)入大腸桿菌 DH5感受態(tài)細(xì)胞中，擴(kuò)增之后在加有相應(yīng)抗生素的 LB平板上篩選陽 性克隆，這對后續(xù)生物信息學(xué)分析等有重要意義。第二次實(shí)驗(yàn)是用CTAB法提取甘薯DNAPCR擴(kuò)增再凝膠電

2、泳檢測純度。(提取DNA也能擴(kuò)增出ADK基因核心片段)關(guān)鍵詞：甘薯、PCF技術(shù)、腺苷酸激酶片段(AD)基因克隆、轉(zhuǎn)化Abstract: Sweet potato for my agriculturalmain cultivation crop, and is molecularbiology laboratory com mon material, this times experime nt main to sweet potatoleaves (part for stems) for experiment material, first times experiment from mate

3、rial in the extract ion RNAa nd reverse recorded cDNAfirst cha in, by PCRspread in creased get large ADK gene core fragme nts, electrophoresis detecti on rubberrecycling ADK gene core fragments, will its and t carrier connected and importEscherichia coli DH5 (feel State cell in the, spread in crease

4、d inplus hascorresponding antibioticsof LB Tablet Shang filter positiveclone This importaneeto subsequent bioinformatics analysis. The second experiment was extracted by CTAB method DNA,PCR amplificati on and gel electrophoresis and purity of sweet potato.(Extractio n of core fragme nt of DNA can be

5、 amplified ADK gene)key words: sweet potato; PCRtechnologies;Adenylate Kinase Gene( adk ); gene clone:tran sformati on1.綜述1.1甘薯甘薯(Ipomoea batatas (L. ) Lam.)屬旋花科(Convolvulaceae) 甘薯屬(Ipomoea)蔓生一年生草本植物，染色體數(shù)為 2n=6x=90。其又名山芋、紅芋、番薯、紅薯、白薯、地瓜、紅苕等，因地區(qū)不同而有不同的名稱，經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高可食用也可入藥世界甘薯主要產(chǎn)區(qū)分布在北緯 40°以南。栽培面積以亞洲最多

6、，非洲次之，美洲居第 3位。1994年世界甘薯總面積為938萬公頃，總產(chǎn)量為12433.9萬噸。甘薯是我國的主要 栽培作物，常年種植面積 6X106 hm2左右，栽培面積和總產(chǎn)量均居世界首位，它所富含的 淀粉是重要的輕化工和食品加工原料。選育推廣優(yōu)良品種是農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的重要措施，因此，在農(nóng)業(yè)科技工作中，選育和推廣優(yōu) 良品種始終處于重要地位，“渝蘇303”是西南師范大學(xué)在育成“渝蘇1號”、“渝薯34 ”、 “渝薯20”之后，于1991年從江蘇省農(nóng)科院提供的雜交種籽中選育而成的又一個(gè)甘薯新品 種，原系號“ 91 一 31 一 303”，該品種（系）19941995年參加四川省甘薯新品種區(qū)域試 驗(yàn)，19

7、97年5月、1998年1月和1999年4月分別通過四川省、重慶市、江蘇省農(nóng)作物 品種審定委員會審定，1998年該品種在重慶、四川、江西、江蘇、貴州、河南等省市 的種植面積在1X 104hm2以上。經(jīng)過較長較深時(shí)間的研究，甘薯應(yīng)經(jīng)成為西南大學(xué)生命科 學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常用材料，從分子生物學(xué)角度對其進(jìn)行基因水平上的實(shí)驗(yàn)研究 對于提高甘薯的質(zhì)量和產(chǎn)量都有重大意義。1.2 ADK基因腺苷酸激酶（EC.2.7.4.3, adenylate kinase, ADK是生物體內(nèi)普遍存在的一種單體酶， 廣泛存在于生命有機(jī)體中（如微生物、植物和動物體內(nèi)）。腺苷酸激酶（ADK催化ATP和AMP合成兩分子ADP

8、的可逆反應(yīng)，是調(diào)控這三種前體分子在淀粉代謝庫和核酸代謝庫中分配 的關(guān)鍵酶。其表達(dá)量直接影響腺苷酸在糖類代謝庫和核酸代謝庫中的分配。生物信息學(xué)分 析表明，在淀粉合成水平最高的植物中，腺苷酸激酶的分子進(jìn)化水平和遺傳相似性也最 高，因此，作為腺苷酸代謝庫調(diào)節(jié)中樞的 ADK基因（adk）是淀粉代謝工程的重要候選基因， 將該基因表達(dá)量控制在較低水平就可打破腺苷酸代謝庫的平衡，使腺苷酸代謝流向淀粉合成的方向流動。用基因工程技術(shù)獲得的含有ADK基因工程菌菌株可用于遺傳轉(zhuǎn)化馬鈴薯、甘薯和木薯等重要的淀粉作物，為實(shí)現(xiàn)淀粉代謝工程奠定了基礎(chǔ)。IbADK全長1314bp,其 編碼區(qū)長度為855bp,編碼長度為284

9、個(gè)氨基酸殘基的ADK蛋白（IbADK）;生物信息學(xué)預(yù)測 IbADK分子量為30.86kDa，等電點(diǎn)為6.46。1.3研究目的和意義本次試驗(yàn)就是利用從甘薯“渝蘇 303”中提取ADK目的基因，通過連接制備重組 DNA 然后導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞中，通過篩選檢測目的基因是否轉(zhuǎn)化成功。本次實(shí)驗(yàn)涉及甘薯總 RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈過程，PCRT增目的基因及檢測，目的基因回收與連接， 大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞的制備，連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化篩選和 PCF檢測，以及選做實(shí)驗(yàn)植物DNA 的提取及檢測。原理上根據(jù)目的基因的制備，重組DNA分子的構(gòu)建，重組DNA分子轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子的篩選，和目的基因表達(dá)與

10、功能的鑒定的操作步驟，從分子層面直觀的 告訴我們了基因工程技術(shù)中的操作方法和實(shí)現(xiàn)手段。腺苷酸激酶(ADK)在維持細(xì)胞能量平衡中起著重要作用,也就對農(nóng)作物的產(chǎn)量的提升 具有很大的重要作用，不僅是在農(nóng)作物光合作用的效率的提升上，也在像甘薯這樣積累淀 粉的農(nóng)作物的生產(chǎn)量的提高上面具有很大的作用。弄清楚了甘薯中的ADK基因的序列，對于有征對性的提高甘薯的產(chǎn)量具有直接的關(guān)系。2. 材料與方法2.1材料2.1.1實(shí)驗(yàn)材料：甘薯葉片2.1.2 實(shí)驗(yàn)工具PCRT增儀，電泳儀，恒溫培養(yǎng)箱1臺，恒溫水浴鍋，THZ-C水平搖床2臺，離心機(jī)1 臺，超凈工作臺1臺，移液槍1套，錐形瓶3X 10個(gè)，室內(nèi)使用的大中型槍頭各

11、1盒，兩 面板(藍(lán)板)1個(gè)，室內(nèi)使用的1.5mL的EP管1套。涂布器1根，凝膠成像系統(tǒng)1臺，一 次性PE手套，研缽、杵、藥勺1套。2.1.3實(shí)驗(yàn)試劑裂解液RZ氯仿，無水乙醇，蛋白液RD漂洗液RW，oading buffer , Super Pure dNTPS, RNase-FreeddH2O,buffer,RNasi n,TIANScriptM-MLV, MiniQ H2O,10 X PCRbuffer,MgCI2,dNTPmix, 引物 1,引物 2，Taq,瓊脂糖，TAE, Gold View ,B -巰基乙醇， 平衡液 BL，PN緩沖液 EB,PMD-19Vector, Insert

12、DNA,Solution I, CATB液氮，異丙醇， 乙醇，CaCl2, LB液體培養(yǎng)基，Amp抗生素，IB固體培養(yǎng)基2.2方法2.2.1植物RNA的提取及檢測及反轉(zhuǎn)錄植物RNA勺提取實(shí)驗(yàn)方法參見總RNA提取試劑盒說明書。反轉(zhuǎn)錄過程如下：1. 在離心管中加入 2 ul RNA 2 ul 引物，2 ul Super Pure Dntps,8.5 ul RNase-Free ddH202.70 C水浴加熱5分鐘后，冰上冷卻2分鐘，再進(jìn)行簡短離心3.加入 4 ul Buffer ，0.5 ul RNasin4.力卩1 ul TIANScript M-MLV,輕輕用移液器混勻注意事項(xiàng)如下:1. 第一

13、次離心過后，吸取上清液 400 ul另一離心管中，呈淡粉色。2. 共經(jīng)過7次離心，均為常溫離心，每次離心后加入的試劑不同，需細(xì)心。3.簡短離心的步驟與正常離心不同，控制時(shí)間2.2.2 PCR擴(kuò)增adk基因核心片段(1)在2個(gè)50ul的PCR反應(yīng)管中依次加入如下組分：PCF反應(yīng)體系:39.52)10 x PCR buffer(含Mg離子)1)Mi niQH2O3)10mM dNTP mix4)引物 1(10 卩 M) F-ADK5)引物 2(10 卩 M) R-ADK)Taq(2 to 5 units/ul)7)模板(DNA)0.5總體積50.0(2)短暫離心混勻各組分后，將PCF反應(yīng)管放入PC

14、F儀。1min(33個(gè)循環(huán))PCR反應(yīng)的程序如下：I)94 C4mi nII)94 C45s ;in)72 C8minIV)4C保存56 C 45s;72 C(3)將PCR物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果223膠回收adk基因片段和連接T載體及大腸桿菌的培養(yǎng)1)膠回收adk基因片段按照提供的普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒一-離心柱型中所述的方法對已檢測并可使用的adk基因片段進(jìn)行回收1. 柱平衡步驟：向吸附柱CA2中加入500ul平衡液BL,12000rpm(13400X g)離丿鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放入收集管中。2. 將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下

15、放入干凈的離心管中，稱取重量。3.向膠塊中加入3倍體積溶膠液PN因?yàn)槟z重為0.1g，其體積可視為100ul 類推。50 r水浴放置10分鐘，期間不斷溫和的上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。，以此4. 將上一步所得溶液加入另一個(gè)吸附柱CA2中室溫放置2分鐘，12000rpm (1g)離心3060秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 CA2放入收集管中。5. 向吸附柱 CA2中加入700ul漂洗液PW 12000rpm (13400X g)離心3060 掉收集管中的廢液，將吸附柱 CA2放入收集管中。3400X秒，倒6.向吸附柱 CA2中加入500ul漂洗液PVy 12000rpm (13400X

16、 g)離心3060掉收集管中的廢液。秒，倒7.將吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm (13400X g)離心2分鐘，盡量出去漂洗液。將吸附柱CA2置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。8.將吸附柱CA2放到一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加30ul洗j脫緩沖液EB 水浴37C2分鐘。12000rpm (13400X g)離心2分鐘收集DNA溶液。2)連接T載體1.在200ulEP管中加入下列組分:PMD-19TVector0.5ulIn sert DNA4.5ulSolution I5 ul2.輕輕混勻，16C連接30分鐘 3)大腸桿菌搖床培養(yǎng)部分同學(xué)在老師指導(dǎo)下已完成2.2.4 D

17、NA的提取及大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1 ) DNA的提取1、向10ml離心管中預(yù)先加入4mlCTABt提液及相應(yīng)量的B -巰基乙醇(2%-3%, 65C預(yù)熱；2 、取適量的植物甘薯嫩葉用液氮充分磨成粉末，轉(zhuǎn)入該10ml離心管中，迅速混勻。3、于65E水浴45min,中途間隔(輕柔)顛倒混勻三次或四次；4、冷至室溫后加入等體積(4ml)氯仿，輕柔顛倒混勻使乳化10min;5、10000轉(zhuǎn)/分離心 10min (18-20 C)；&吸取上清3-4ml于另一干凈的10ml離心管中；157、吸取上清加入與上清液等體積且已于-20 C預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置 分鐘至白色絮狀沉淀出現(xiàn)；8、

18、 用玻璃鉤子挑出 DNA放入盛有1ml 75%乙醇的1.5ml Eppendof 管中9、用75%L醇中漂洗DNA沉淀，用Tip頭吸干乙醇；10、用1ml 75%乙醇再漂洗一次；11、用無水乙醇再漂洗一次；12、沉淀于室溫或60C以下的恒溫箱中干燥片刻至剛出現(xiàn)半透明；13、用500卩l(xiāng) TE溶解沉淀，可用65C水浴助溶，得DNAE提物。14、取10卩l(xiāng) DNA電泳檢查DNA的質(zhì)量；2)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備1. 將1ml過夜培養(yǎng)菌液移入 50mlLB培養(yǎng)基中，37C震蕩培養(yǎng)至 0D值為0.3-0.62. 取培養(yǎng)液3 ml轉(zhuǎn)入10ml無菌離心管中，于 4°C 4000r/min離心1

19、0min，去上清3. 沉淀用3ml預(yù)冷的0.1MCaCI2懸浮，與冰上放置30分鐘；4. 4 C，4000r/min離心 10min,去上清；5. 沉淀用600卩l(xiāng)冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液，小心懸浮細(xì)胞6. 分裝3管，每管200卩l(xiāng) ，冰上放置30分鐘2.2.5連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化、篩選及 PCF檢測1.將10卩l(xiāng) DNA的連接物加入一管感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后放置冰上30分種；2.42 C水浴中熱激恰恰90sec，迅速取出立即放于冰上 2min，室溫下放置3-5mn ；3. 加入800 l 37 C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，混勻后 37C 180 rpm 培養(yǎng)0.5h4.4000 rpm 離

20、心10min，去800 l上清液，將剩余的 200 l菌液混勻；5. 用燒烤過的涂布棒將100 l的菌液涂布于加相應(yīng)抗生素的 LB固體培養(yǎng)基涂勻，共6. 置于37 C恒溫箱中培養(yǎng)226連接產(chǎn)物的篩選及PCR僉測1. 選取平板上合適菌落，標(biāo)記備用（共 4個(gè)）2. 用10卩l(xiāng)移液器槍頭對準(zhǔn)所選菌落刮取，置于裝有1ml溶液的EP管中3. 將EP管進(jìn)行搖床培養(yǎng)4. PCF檢測3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.1甘薯RNA的提取及檢測+反轉(zhuǎn)錄msu 12345628 Sf 工18 S-* 圖1-1 總RNA勺電泳圖（初）圖1-2 總RNA的電泳圖（末）5.8 A結(jié)果分析：RNA極易被RNA酶降解，而RNA酶在自然

21、界中廣泛而豐富的存在， 因此要取得本次實(shí)驗(yàn)的成功關(guān)鍵之處在于嚴(yán)格防止RNA酶的污染。此外，為了達(dá)到更佳的效果，實(shí)驗(yàn)選用的材料是甘薯嫩葉，因?yàn)槠銻NA含量豐富，但實(shí)驗(yàn)中能否研磨充分，也會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。從RNA電泳的結(jié)果來看，我們組在該次實(shí)驗(yàn)中較好地做到了這兩點(diǎn)，因此獲得的條帶不僅區(qū)分度好，亮度也高。在實(shí)驗(yàn)中共進(jìn)行了兩次紫外檢測，首次檢測是在預(yù)期時(shí)間后，但發(fā)現(xiàn)RNA條帶跑的不是很開（如圖1-1），分析原因是配制瓊脂糖凝膠時(shí)膠濃度比期望濃度大， 致使RNA遷移速率減慢，因而電泳時(shí)間相對延長。由于在電場中核酸分子的遷 移速率取決于分子量大小和空間構(gòu)型，沉降系數(shù)大的RNA跑得慢，故從上到下的條帶分

22、別代表28S、18S、5.8S （如圖1-2）。從電泳獲得的28S和18S兩條主 帶的亮度來看，28S和18S RNA比值約為2:1，符合一般真核細(xì)胞 RNA比值。3.2PCR擴(kuò)增adk基因核心片段圖2 PCR擴(kuò)增adk基因的電泳圖結(jié)果分析：上次實(shí)驗(yàn)中，我們對獲得的甘薯RNA進(jìn)行了反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。本次實(shí)驗(yàn)利用上次實(shí)驗(yàn)獲得的 cDNA進(jìn)行PCR，所用的10X PCR buffer、taq 是北京普博欣公司生產(chǎn)，而引物1、引物2系華大公司生產(chǎn)（1、2組），其他四 組用其他公司生產(chǎn)的試劑盒。從擴(kuò)增結(jié)果來看，效果均不錯(cuò)（1-4組擴(kuò)增的是adk 基因，5、6組擴(kuò)增的是adk核心片段，故結(jié)果有所差異

23、）。通過與Marker跑出 的條帶對比，擴(kuò)增的目的基因在 1000750 bp之間（Marker各條帶從上到下分 別表示2000、1000 750、500、250、100,后面3個(gè)不太明顯）。本次實(shí)驗(yàn)每個(gè)組共做了 2個(gè)50讓反應(yīng)體系，但待加完所有試劑后，很多體系的 體積明顯不同，分析原因可能是在操作過程中使用移液槍出現(xiàn)問題，或是移液 槍本身有誤差。3.3目的基因片段的回收、連接上次實(shí)驗(yàn)我們擴(kuò)增到了甘薯adk目的基因，并進(jìn)行了電泳，得到了單一目的DNA 條帶，本次實(shí)驗(yàn)將該目的DNA條帶切下，進(jìn)行膠回收和T載體連接。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行 順利。根據(jù)時(shí)間安排，本次連接過夜，是連接更加完全3.4DNA的提取、大腸

24、桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化3.4.1DNA的提取圖4-1 提取DNA吉果圖圖4-2 提取DNA的電泳圖結(jié)果分析：本次提取DNA使用的材料仍是甘薯，所用植物材料的量和研磨是否 充分是影響獲得 DNA量多少的兩個(gè)主要方面，與其他組相比，我們組提取的 DNA量比較充足（如圖4-1所示）。將此DNA沉淀溶解后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳， 得到3條清晰可區(qū)分的帶，從上向下依次代表蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)、DNA、RNA （如圖4-2所示），較其他組而言，我們組 DNA條帶亮度高，說明提取的 DNA 量多。RNA分帶不明顯，說明有部分降解，但未被降解完全。3.5連接產(chǎn)物的篩選及PCR檢測結(jié)果分析：我們組的兩個(gè)

25、加了氨芐抗生素的 LB培養(yǎng)基上共長出了 4個(gè)大腸桿菌 菌落（分給了 2組一個(gè)），這幾個(gè)菌落形狀都比較規(guī)則，判斷是由一個(gè)大腸桿菌 長成，由于它們能夠在加了氨芐抗生素的培養(yǎng)基上長出，說明它們具有氨芐抗 性，說明有T載體導(dǎo)入，但無法確認(rèn)該 T載體上是否有我們所需的adk目的基 因，還需進(jìn)一步菌檢。由PCR菌檢結(jié)果可知（如圖5-2），該3個(gè)菌落雖都是轉(zhuǎn)化子，但3號菌落菌檢 無條帶，說明3號菌落是假陽性的，而1、2號菌落則是我們所要得到的菌落 整個(gè)分子實(shí)驗(yàn)取得成功。取得這樣的結(jié)果，有一部分運(yùn)氣在里面，但全組成員 在此過程中的嚴(yán)謹(jǐn)操作也是必不可少的重要因素分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)感想四天的分子實(shí)驗(yàn)結(jié)束了，時(shí)間看似漫

26、長，卻也如此短暫，回首這 四天的實(shí)驗(yàn)經(jīng)歷，有辛苦，有疲憊，但也不乏成就感和喜悅感，在老 師的指導(dǎo)下，和同學(xué)們一起完成實(shí)驗(yàn)，這樣的過程總是那樣美好，讓 人留戀，當(dāng)然，實(shí)驗(yàn)過程中收獲到的心得體會對于我來說最為寶貴。作為我們一組的記錄員，說實(shí)話，工作有些辛苦，但是我覺得很 快樂，這份工作很適合我，也正是我喜歡與擅長的方面。從實(shí)驗(yàn)當(dāng)初 的迷茫，到實(shí)驗(yàn)最后的嫻熟，我也不得不佩服自己的耐心與細(xì)心， 這 是我以前沒有發(fā)現(xiàn)的優(yōu)點(diǎn)，希望以后可以得以施展和加強(qiáng)鞏固。由于做記錄員，工作比較繁雜，所以實(shí)驗(yàn)中我只做些簡單的操作， 比如離心、計(jì)時(shí)等，但對于整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程我還是比較了解的， 這也是 記錄員的好處吧！在這方面我

27、的收獲還是蠻大的，至少懂得實(shí)驗(yàn)過程 是馬虎不得的，有一步失誤，就可能導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)的失敗。我們組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都很順利， 包括后面對菌的培養(yǎng)，長出 了四組明顯菌落，并且發(fā)現(xiàn)了 2個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子，這種結(jié)果是我們期待 的，同樣也是我們沒有想到的，心里別提有多開心了，感覺這四天的 努力沒有白費(fèi)，一切辛苦都是值得的。以上所說的都是我在實(shí)驗(yàn)中的體會，接下來我想說的是實(shí)驗(yàn)過后 我的感想，這些感想比實(shí)驗(yàn)中那些匆匆的心情增加了許多反思與積 淀。給我留下最深印象的應(yīng)該是周四那天晚上，也就是實(shí)驗(yàn)結(jié)束，曾老師在講臺上給我們講了一些事情的那堂晚課， 記得當(dāng)時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果還 沒出來，曾老師給我們講實(shí)驗(yàn)報(bào)告該怎么書寫， 其中提

28、到了實(shí)驗(yàn)結(jié)果 的問題，曾老師說“實(shí)驗(yàn)失敗了并不可怕，這很正常，不要被這件事 影響了心情”，之后又舉了很多他經(jīng)歷的實(shí)驗(yàn)失敗，告訴我們要學(xué)會 總結(jié)和反思，說實(shí)話，有那么一大段時(shí)間我都是眼含淚花地聽著他講 話，不時(shí)地笑一下回應(yīng)，心里很溫暖，他真的是個(gè)好老師，懂得怎么 教育學(xué)生，很多老師都會采用批評的口吻總結(jié)課堂， 那樣的方式我們 早就厭倦了，而他卻用不同的方式告訴了我們真理，這讓我很感動， 也很崇拜，即使失敗，老師也還在關(guān)照著我們的內(nèi)心，那份感謝不知 怎樣用語言來表達(dá)，我想我會永遠(yuǎn)地記得他的教育方式， 來教育我的 學(xué)生，用那份寬容來對待我身邊的人。曾老師讓我們對他提一些建議， 我只想提一點(diǎn)：希望您繼

29、續(xù)溫暖 可愛的孩子們，用您一直寬容的心對待您的學(xué)生們！實(shí)驗(yàn)過程中，有老師幫助，同學(xué)的團(tuán)結(jié)，有工具、藥劑的陪伴， 我感到很幸福，很充實(shí)，認(rèn)真對待每一件事，每一個(gè)人，正確看待自 己，定位未來的道路，相信明天會更好。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)感想本次實(shí)驗(yàn)我們做了 RNA的抽提與檢測、RNA逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA 及檢測、PCR擴(kuò)增目的的基因及檢測、目的基因片段的回收與連接、 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和篩選及PCR的檢測及DNA的抽提與檢測。此次為期大概四天，實(shí)驗(yàn)中小組成員都想積 極參與，但由于實(shí)驗(yàn)不需要太多人動手，部分人不得不只配和其他組 員完成任務(wù)。本次實(shí)驗(yàn)成功不僅僅是小組成員間的合作成果， 也是

30、全 班各小組共同合作的成果。充分體現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)需要團(tuán)隊(duì)合作。我們充分 利用時(shí)間自覺完成實(shí)驗(yàn)，相對而言效率較高，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為成功。經(jīng)過四天的實(shí)驗(yàn)，我們把 DNA,RNA的提取，PCR擴(kuò)增目的基 因，電泳，膠回收目的片段，連接一T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克 隆篩選，PCR鑒定連起來做，感覺能把整個(gè)實(shí)驗(yàn)串聯(lián)起來，更有利 于實(shí)驗(yàn)知識的學(xué)習(xí)，這幾天實(shí)驗(yàn)做下來心里很踏實(shí)，老師要求寫的實(shí) 驗(yàn)報(bào)告很特殊，我們小組合作的方式完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告， 對實(shí)驗(yàn)知識有進(jìn) 一步的加深。思路得到了開闊。實(shí)驗(yàn)過程中，我們把看不見的DNA提取出來了，也得到了 PCR 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在理論中很難理解的東西，實(shí)驗(yàn)后理解起來更容易了。 經(jīng)過曾令

31、江老師的指導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)中反復(fù)操作后，我們對實(shí)驗(yàn)儀器使用技 術(shù)提高了。此次分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)采取集中時(shí)間按技術(shù)路線流程完成， 不僅節(jié)約時(shí)間，更是讓我們更深入的熟悉理解技術(shù)操作原理。 相比于 其他科目的實(shí)驗(yàn)，每周進(jìn)行一小部分實(shí)驗(yàn)操作，沒有很好地連接起來， 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)更利于我們記憶，效率明顯的有大部分提高。再加上 曾老師的悉心指導(dǎo)及包容，幫助我們從失敗的結(jié)果中得出的經(jīng)驗(yàn)及教 訓(xùn)，改正錯(cuò)誤。從老師身上我們也學(xué)到了細(xì)心，耐心，堅(jiān)持不懈的實(shí) 驗(yàn)精神。這次試驗(yàn)老師才是最辛苦的人。實(shí)驗(yàn)中我們收獲了很多，不但獲得了實(shí)驗(yàn)的相關(guān)知識，讓我們近 距離更直觀的理解了課本上的理論知識，也讓我們加強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)的操作技能，更加注意實(shí)

32、驗(yàn)的相關(guān)事項(xiàng)。實(shí)驗(yàn)中要十分嚴(yán)謹(jǐn)并且要積極觀察 相關(guān)現(xiàn)象。另外，有點(diǎn)小遺憾就是實(shí)驗(yàn)中人數(shù)太多了，器材不夠，很 多同學(xué)沒有真正的參與到實(shí)驗(yàn)的具體操作中來最后，感謝曾令江老師對本次實(shí)驗(yàn)悉心指導(dǎo)與幫助。古麗克孜吐熱克分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)與體會從5月12日開始到5月15日持續(xù)四天沒有嚴(yán)格作息時(shí)間的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，也是大學(xué)里最后的一門實(shí)驗(yàn)課結(jié)束了，反而有一點(diǎn)失落, 不再整天那么忙碌，不習(xí)慣了。實(shí)驗(yàn)中同學(xué)們都和積極，每節(jié)課都能全勤，并且參與實(shí)驗(yàn)，這一門實(shí) 驗(yàn)課是我大三學(xué)年上的最實(shí)在的實(shí)驗(yàn)課， 跟有的實(shí)驗(yàn)是不一樣的，老 師全程陪同、指導(dǎo)，有一個(gè)基本思路，技術(shù)路線，使得實(shí)驗(yàn)不再那么 茫然，不會給一堆新鮮的實(shí)驗(yàn)儀器

33、， PPTI瀏覽一遍然后就把實(shí)驗(yàn)室 扔給我們，最后只要交實(shí)驗(yàn)報(bào)告就行了。在本次實(shí)驗(yàn)中，我體會到了1、實(shí)驗(yàn)以人為本，科研都是為人服務(wù)的，雖然科研工作者都要有為科研獻(xiàn)身的精神，但還是要在實(shí)驗(yàn)中采取措施保護(hù)工作者，以免去不必要的人身損失，就比如在用液氮里研磨甘薯葉片，操作者都要用棉手套和一次性塑料手套，防止凍傷； DNA提取中，研 磨得到的植物組織粉末和經(jīng)65攝氏度預(yù)熱的試劑溫差太大，加入 粉末是，離心管口要朝無人的地方；電泳制膠，染色劑用了 GV 來替代強(qiáng)致癌劑EB等。2、實(shí)驗(yàn)在不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)要節(jié)約資金，做了這么多次實(shí)驗(yàn)分子 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室我首次見到了好幾個(gè)量筒上半部分無刻度的部分損 壞但仍然堅(jiān)守

34、崗位，還在用于實(shí)驗(yàn)，盡管這只是幾只量筒，足以 表現(xiàn)出實(shí)驗(yàn)室管理者節(jié)約的原則。3、小組實(shí)驗(yàn)重于合作，本次實(shí)驗(yàn)我們組雖然全是女生，但是在大家合理分工相互合作下，實(shí)驗(yàn)還是取得了成功，最后挑出的三個(gè)菌落，有兩個(gè)都是陽性轉(zhuǎn)化體。并且在兩個(gè)實(shí)驗(yàn)第一步研磨植物 組織，我們組都率先高質(zhì)量完成。4、作為師范生，我從曾老師身上學(xué)到了要適時(shí)給予學(xué)生鼓勵(lì)，在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化步驟后，培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中7攝氏度培養(yǎng)12到14小時(shí)，再去挑菌落篩選的時(shí)候，有兩個(gè)組培 養(yǎng)皿中一個(gè)菌落也沒有，然后就從其他組挑取單菌落繼續(xù)實(shí)驗(yàn)， 但后續(xù)過程中扔不忘去關(guān)心一下自己組的培養(yǎng)基中有沒有再長出 菌落，老師說了一番話讓人心里暖暖

35、的，給予了大家鼓勵(lì)，老師 說他們起碼是關(guān)心本次實(shí)驗(yàn)的，實(shí)驗(yàn)失敗很正常，只要下去思考 了失敗的原因可能比實(shí)驗(yàn)成功的同學(xué)收獲更多，一次實(shí)驗(yàn)的成功 與否與運(yùn)氣也有一點(diǎn)點(diǎn)關(guān)系5、制膠、點(diǎn)樣、感受態(tài)細(xì)胞的制備、挑菌落、配PCR反應(yīng)體系等等步驟一個(gè)也不能馬虎，在第二次實(shí)驗(yàn)點(diǎn)樣用以跑電泳篩選陽 性轉(zhuǎn)化體時(shí)，我點(diǎn)第三個(gè)孔有點(diǎn)抖，差點(diǎn)把孔捅破，因?yàn)榍皟蓚€(gè) 加10微升，都從孔里浸出來了，實(shí)驗(yàn)技能有待提高。另外反應(yīng)體 系的制備是不能想當(dāng)然的，用的不同產(chǎn)品，配方、濃度不同加的 體積也不一樣，需要慎重，自己計(jì)算。建議：實(shí)驗(yàn)的每一步操作需要的人并不多， 這樣的分組使得一部分同 學(xué)不能很好的參與進(jìn)來，因此個(gè)人建議 3人左右

36、為一組。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)總結(jié)與體會2014年5月12日，我們班的分子生物學(xué)開始動手做了。我們先 對本門課程的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了一個(gè)初步的認(rèn)識：以甘薯葉片為實(shí)驗(yàn)材料， 首先進(jìn)行甘薯的總RNA的提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，PCR擴(kuò) 增ADK基因核心片段，電泳檢測膠回收 ADK基因片段，然后將目 的基因ADK與T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a ,隨后進(jìn)行PCR 的檢測篩選陽性轉(zhuǎn)化子，后續(xù)的還有測序及生物信息的分析等就不需 要我們做了。有了初步的認(rèn)識和技術(shù)流程的熟悉后， 我們下午就開始 了實(shí)驗(yàn)。第一天實(shí)驗(yàn)做了甘薯RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈。這 是第一次做關(guān)于分子生物的實(shí)驗(yàn)， 老師講了原理和注意事項(xiàng)

37、之后，整 個(gè)實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行過程中都非常的安靜。以后的實(shí)驗(yàn)上老師對我們的要求 也很嚴(yán)格，所以最后我們每個(gè)組基本上都有了結(jié)果。當(dāng)然從效果上看， 我們組的效果是最好的：我們挑了三個(gè)菌落進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出來 我們有兩個(gè)是陽性的。在本次實(shí)驗(yàn)中我收獲的東西不僅僅是實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 收獲更多的是實(shí) 驗(yàn)時(shí)的一些操作方法（如 PCR技術(shù)、凝膠的配制等）和與伙伴們的 協(xié)調(diào)配合，還有對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析等（如果一次實(shí)驗(yàn)失敗了，懂得如 何分析出失敗的原因）。通過本實(shí)驗(yàn)，讓我真正地清楚了克隆 ADK 基因的核心片段整個(gè)操作流程，記住了很多主要步驟的原理。當(dāng)然，有收獲也有遺憾的地方，比如：1在實(shí)驗(yàn)過程中我容易出現(xiàn)“照方抓藥”的情況，自己并不完全 的明白我所做的這一個(gè)步驟有什么作用，就跟著實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)上的步驟跟 著做了，缺乏了很多的思考。所以在今后的學(xué)習(xí)中，希望自己能多學(xué) 會思考所做的每一步有什么意義。2.實(shí)驗(yàn)分組中每個(gè)組的人太多，每個(gè)組都有 5個(gè)人或以上，但是