脂肪干細胞614

1、動物科技學院動物科技學院 楊公社楊公社adipose-derived mesenchymal stem cells匯報提綱匯報提綱一、研究背景一、研究背景 動物體內，脂肪組織不僅是重要的能量貯存庫和動物體內，脂肪組織不僅是重要的能量貯存庫和賦形組織，還是保持內環(huán)境穩(wěn)定及具有分泌激素和細賦形組織，還是保持內環(huán)境穩(wěn)定及具有分泌激素和細胞因子的重要部位。脂肪細胞增殖與分化失常是導致胞因子的重要部位。脂肪細胞增殖與分化失常是導致肥胖及肥胖及型糖尿病的重要因素。因此，脂肪細胞分化型糖尿病的重要因素。因此，脂肪細胞分化的研究一直是國內外醫(yī)學及生物學領域的研究熱點之的研究一直是國內外醫(yī)學及生物學領域的研究熱

2、點之一。一。 背景知識背景知識 背景知識背景知識二、脂肪源間充質干細胞的優(yōu)點二、脂肪源間充質干細胞的優(yōu)點 首先，從人類醫(yī)學角度說，獲取脂肪間充質干首先，從人類醫(yī)學角度說，獲取脂肪間充質干細胞比骨髓源性干細胞容易的多。皮下脂肪切除術細胞比骨髓源性干細胞容易的多。皮下脂肪切除術是一種普通的外科手術，其安全性高、對患者帶來是一種普通的外科手術，其安全性高、對患者帶來的痛苦小。即的痛苦小。即amscs具有易獲得性、安全、可迅具有易獲得性、安全、可迅速擴增及多向分化能力等特點，其將成為具有廣闊速擴增及多向分化能力等特點，其將成為具有廣闊治療應用前景的一類成體干細胞。治療應用前景的一類成體干細胞。 其次，

3、脂肪組織比骨髓中所含干細胞比率大。其次，脂肪組織比骨髓中所含干細胞比率大。 通通過成纖維細胞集落形成單位比較脂肪組織顯示，成人過成纖維細胞集落形成單位比較脂肪組織顯示，成人骨髓來源細胞中成纖維細胞集落形成單位出現頻率為骨髓來源細胞中成纖維細胞集落形成單位出現頻率為1/500001/500001/10000001/1000000，而當脂肪組織用膠原酶消化，而當脂肪組織用膠原酶消化，除去上層漂浮的成熟脂肪細胞，下層細胞中成纖維細除去上層漂浮的成熟脂肪細胞，下層細胞中成纖維細胞集落形成單位的頻率為胞集落形成單位的頻率為1/1001/100，說明脂肪組織中，說明脂肪組織中干細干細胞數目至少是骨髓的胞數

4、目至少是骨髓的500500多倍多倍 。脂肪間充質脂肪間充質干細胞優(yōu)點干細胞優(yōu)點 最后，從經濟和社會效益看，從脂肪組織中獲最后，從經濟和社會效益看，從脂肪組織中獲取干細胞可將原本認為是廢棄物的脂肪，如臨床上取干細胞可將原本認為是廢棄物的脂肪，如臨床上脂肪抽吸術后的脂肪組織及動物屠宰后不可實用的脂肪抽吸術后的脂肪組織及動物屠宰后不可實用的內臟脂肪等變?yōu)楦杉毎麕斓闹匾獊碓?，具有極大的內臟脂肪等變?yōu)楦杉毎麕斓闹匾獊碓?，具有極大的經濟與社會效益。經濟與社會效益。脂肪間充質脂肪間充質干細胞優(yōu)點干細胞優(yōu)點 關于脂肪間充質干細胞標志，目前尚無統一標關于脂肪間充質干細胞標志，目前尚無統一標準。一般認為，脂肪間充

5、質干細胞和骨髓間充質干準。一般認為，脂肪間充質干細胞和骨髓間充質干細胞均表達細胞均表達cd44、cd105、stro-1、cd166及及cd117。其中。其中cd117是一種干細胞因子受體，在全是一種干細胞因子受體，在全能或多能干細胞中表達，包括胚胎干細胞。能或多能干細胞中表達，包括胚胎干細胞。表面標記表面標記 除了上述幾種標記外，脂肪間充質干細胞也表達除了上述幾種標記外，脂肪間充質干細胞也表達其他多種分子標記，包括其他多種分子標記，包括cd29（1-整合素，在血管整合素，在血管發(fā)生治療中起重要作用）、發(fā)生治療中起重要作用）、cd44（透明質酸鹽）和（透明質酸鹽）和cd49e（5 -整合素，在

6、細胞粘附纖連蛋白中起重要整合素，在細胞粘附纖連蛋白中起重要作用）等。作用）等。表面標記表面標記 不同研究組對脂肪間充質干細胞表面標記的鑒不同研究組對脂肪間充質干細胞表面標記的鑒定結果并不完全一致，如定結果并不完全一致，如gronthos等發(fā)現等發(fā)現amscs不不表達表達stro-1，但，但zuk等發(fā)現表達等發(fā)現表達stro-1。這些不一。這些不一致的結果可能與細胞所處狀態(tài)及純度有關。致的結果可能與細胞所處狀態(tài)及純度有關。 表面標記表面標記報道文獻報道文獻amscs表面標記表面標記陽性陽性陰性陰性gronthos，2001cd44、cd49d、cd49e、cd54、cd55、cd59、cd105

7、、cd106和和hla-abccd14、cd45、cd50、cd56、hla-dr和骨髓和骨髓基質細胞表面分子基質細胞表面分子stro-1zuk，2002cd13、cd29、cd44、cd105、cd71、stro-1cd14、cd16、cd31、cd34、cd45、cd106、cd56de ugarte，2003cd13、cd29、cd44、cd105、cd90、stro-1cd49d、cd54、cd34、cd106aust，2004cd10、cd13、cd29、cd44、cd90、和、和hla-abccd11b、cd45和和hla-dr表面標記表面標記 近幾年的研究結果表明，近幾年的研究結

8、果表明，在合適誘導劑下，脂在合適誘導劑下，脂肪間充質干細胞和骨髓干細胞一樣，肪間充質干細胞和骨髓干細胞一樣，可向脂肪、軟可向脂肪、軟骨、成骨、神經元細胞、成肌細胞、血管內皮細胞骨、成骨、神經元細胞、成肌細胞、血管內皮細胞等方向分化。等方向分化。三、多向分化潛能三、多向分化潛能多向分化潛能多向分化潛能strem bm, 2005多向分化潛能多向分化潛能分化分化方向方向相關文獻相關文獻骨骼肌骨骼肌mizuno, 2002；bacou, 2004；陳希平陳希平, 2004心肌心肌rangappa, 2003；planat-benard, 2004；yamada, 2006(棕棕色脂肪組織色脂肪組織)

9、；張端珍張端珍, 2005；王燕王燕, 2005成骨成骨zuk, 2001, 2002；halvorsen, 2000；hattori, 2004；陳希哲陳希哲, 2004軟骨軟骨huang, 2004；winter, 2003；嚴笠嚴笠, 2005脂肪脂肪zuk, 2001, 2002；sen, 2001；von heimburg d, 2001神經神經safford, 2004；ashjian, 2003；rchman, 2004；楊立業(yè)楊立業(yè), 2003, 2004 脂肪間充質干細胞向不同細胞分化是在特異性脂肪間充質干細胞向不同細胞分化是在特異性誘導因子作用下進行的。誘導因子作用下進行的

10、。 下面介紹常用的一些多向誘導分化因子及誘導下面介紹常用的一些多向誘導分化因子及誘導后的細胞特性。后的細胞特性。多向分化潛能多向分化潛能 細胞類型細胞類型 誘導物誘導物 細胞特性細胞特性 脂肪細胞脂肪細胞 地塞米松,異丁基甲基黃嘌，胰島素等 細胞中充滿脂滴，油紅o染色陽性成骨細胞成骨細胞 2-磷酸抗壞血酸, -甘油磷酸 ，地塞米松等鈣化性基質產物 ，茜素紅染色陽性骨骼肌細胞骨骼肌細胞 地塞米松，氫化可的松，或5-氮雜胞苷 多核形態(tài)，骨骼肌肌性素重鏈/myod表達 心肌細胞心肌細胞 5-氮雜胞苷 細胞圓形，-肌動蛋白和肌鈣蛋白-i表達 神經元細胞神經元細胞 -巰基乙醇或者異丁基甲基黃嘌, 消炎痛

11、等細胞縮小、周圍有多個神經突起 內皮內皮細胞細胞 血管內皮細胞生長因子，堿性成纖維細胞生長因子 細胞之間形成網格樣結構 ，表達內皮細胞特異性抗原 肝肝( (實質實質) )細細胞胞肝細胞生長因子， 抑瘤素m表達白蛋白和 -胎蛋白 肝實質細胞肝實質細胞 在在20062006年年4 4月第月第1616卷卷4 4期的自然科學進展上，裴雪濤期的自然科學進展上，裴雪濤等人發(fā)表的文章等人發(fā)表的文章人脂肪來源的干細胞體外培養(yǎng)特性及人脂肪來源的干細胞體外培養(yǎng)特性及分化為肝細胞樣細胞的研究分化為肝細胞樣細胞的研究。 脂肪源性干細胞的分離因物種不同消化方法不同。脂肪源性干細胞的分離因物種不同消化方法不同。本實本實驗

12、室采用型膠原酶消化法分離獲得豬脂肪源干細胞，表達脂驗室采用型膠原酶消化法分離獲得豬脂肪源干細胞，表達脂肪干細胞表面標記，在合適誘導劑下，這些細胞分化成了成肪干細胞表面標記，在合適誘導劑下，這些細胞分化成了成骨細胞、成肌細胞和脂肪細胞，在此作一簡單介紹。骨細胞、成肌細胞和脂肪細胞，在此作一簡單介紹。四、豬四、豬amscs的培養(yǎng)及誘導分化的培養(yǎng)及誘導分化 細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)7-8 天后，細胞生長即可達天后，細胞生長即可達80 %-90 %融合，貼壁細融合，貼壁細胞緊密排列成漩渦狀、網狀、輻射狀，有一定的方向性，集落大小胞緊密排列成漩渦狀、網狀、輻射狀，有一定的方向性，集落大小不一，含數個至數百個細胞

13、不等；集落中細胞形態(tài)為典型梭形細胞不一，含數個至數百個細胞不等；集落中細胞形態(tài)為典型梭形細胞(圖圖a)，這就是我們所要分離獲得的豬，這就是我們所要分離獲得的豬amscs。原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)14 d 左右左右即可形成致密單層即可形成致密單層(圖圖b)。 baamscs的培養(yǎng)特性的培養(yǎng)特性cd44+ (50) cd105+ (100) cd14 (50) cd34 (100) cd106 (100)hla-dr (50) 利用免疫組織化學方法檢測豬利用免疫組織化學方法檢測豬amscsamscs特異性表面標記，結果：特異性表面標記，結果：cd44cd44和和cd105cd105呈陽性。呈陽性。cd1

14、4cd14，cd34,cd106,hla-drcd34,cd106,hla-dr均為陰性。均為陰性。amscs的表面標記的表面標記 在地塞米松、抗壞血酸和在地塞米松、抗壞血酸和磷酸甘油鈉的誘導作用下，豬脂磷酸甘油鈉的誘導作用下，豬脂肪間充質干細胞逐漸由成纖維樣的長梭形（對照組，圖肪間充質干細胞逐漸由成纖維樣的長梭形（對照組，圖a a）變?yōu)槌桑┳優(yōu)槌晒菢拥姆綁K形，細胞堆積呈卵圓形或方形（圖骨樣的方塊形，細胞堆積呈卵圓形或方形（圖b b） 。ab成骨誘導成骨誘導成骨誘導后的形態(tài)學觀察成骨誘導后的形態(tài)學觀察b 茜素紅染色茜素紅染色檢測誘導細胞的礦物質沉積狀況，結果：豬脂肪間檢測誘導細胞的礦物質沉積狀

15、況，結果：豬脂肪間充質干細胞在成骨誘導第充質干細胞在成骨誘導第7 7天開始出現小的點狀鈣化斑（天開始出現小的點狀鈣化斑（a a），誘導），誘導第第1414天形成廣泛的鈣化結節(jié)（天形成廣泛的鈣化結節(jié)（b b）。誘導）。誘導2121天鈣化結節(jié)更加明顯連天鈣化結節(jié)更加明顯連接成片（接成片（c c）。）。d d為對照組。為對照組。cb成骨誘導成骨誘導 actinocn 165bpcol-1 539bp actinrt-pcr檢測成骨標志基因檢測成骨標志基因col- 1 （型骨膠原）及型骨膠原）及ocn（骨鈣素）表達（骨鈣素）表達 m: marker; 1-4分別為第0天，7天，14天，21天ocn的表

16、達; 5-8為col- 1的表達。 結果：在成骨誘導分化的早期（第結果：在成骨誘導分化的早期（第7 7天），可檢測到成骨特天），可檢測到成骨特異性基因異性基因型骨膠原和骨鈣素的表達，隨著誘導時間的增加，型骨膠原和骨鈣素的表達，隨著誘導時間的增加，2 2個基因的表達量呈上升趨勢。個基因的表達量呈上升趨勢。成骨誘導成骨誘導rt-pcrrt-pcr檢測標志基因檢測標志基因mrnamrna的表達的表達 上述結果說明：在合適誘導劑下，豬脂肪上述結果說明：在合適誘導劑下，豬脂肪間充質干細胞形態(tài)和排列均發(fā)生變化，成纖維間充質干細胞形態(tài)和排列均發(fā)生變化，成纖維樣的長梭形變?yōu)槌晒菢拥姆綁K形，細胞堆積呈樣的長梭形

17、變?yōu)槌晒菢拥姆綁K形，細胞堆積呈卵圓形或方形，茜素紅染色和卵圓形或方形，茜素紅染色和 rt-pcr均表明均表明可以誘導分化成骨細胞。可以誘導分化成骨細胞。成骨誘導成骨誘導 成肌誘導第成肌誘導第7 7天出現細胞球形變化天出現細胞球形變化(a)(a)，誘導第，誘導第1414天開始出現天開始出現接觸、融合。部分出現偽足，形態(tài)變長接觸、融合。部分出現偽足，形態(tài)變長(b)(b)，誘導第，誘導第2121天周圍梭形天周圍梭形細胞明顯減少，形成巨大的球形細胞細胞明顯減少，形成巨大的球形細胞(c,d)(c,d)。上圖為。上圖為茜素紅染色。茜素紅染色。abdc成肌誘導成肌誘導成肌誘導后的形態(tài)學觀察成肌誘導后的形態(tài)學

18、觀察成肌誘導后肌紅蛋白成肌誘導后肌紅蛋白(myoglobin(myoglobin) )免疫熒光染色免疫熒光染色 成肌誘導第成肌誘導第1414天，可檢測到肌紅蛋白天，可檢測到肌紅蛋白(myoglobin(myoglobin) )的表的表達達( (圖圖a)a)，第，第2121天表達明顯增加（圖天表達明顯增加（圖b)b)。成肌誘導成肌誘導免疫熒光染色免疫熒光染色-actin 399 bpmyod 243 bp myf5 154bp 上圖是用上圖是用5-5-氮雜胞苷誘導氮雜胞苷誘導1 1周后的結果，由圖可以看出周后的結果，由圖可以看出, , 誘導一誘導一周后即可檢測到成肌細胞分化早期表達基因周后即可檢

19、測到成肌細胞分化早期表達基因myf5myf5和和myodmyod的表達。的表達。rt-pcr 檢測成肌標志基因的表達檢測成肌標志基因的表達1為對照，2為myf5(成肌調節(jié)因子)，3為myod(生肌決定因子) 成肌誘導成肌誘導肌細胞標志基因肌細胞標志基因mrnamrna的表達的表達成脂誘導后的形態(tài)學觀察成脂誘導后的形態(tài)學觀察誘導誘導48 h(100)誘導誘導21 d(100)對照對照21 d(100)脂滴融合脂滴融合(200) 豬脂肪間充質干細胞經成脂誘導豬脂肪間充質干細胞經成脂誘導48h48h后，細胞胞漿內出現個別脂滴后，細胞胞漿內出現個別脂滴( (圖圖a)a)，隨著誘導時間的延長，隨著誘導時

20、間的延長, ,充脂細胞數量增加充脂細胞數量增加( (圖圖b) b) ，且小脂滴逐漸，且小脂滴逐漸融合成大脂滴融合成大脂滴( (圖圖c)c)。對照組細胞無充脂細胞出現（圖。對照組細胞無充脂細胞出現（圖c c）。）。acbd成脂誘導成脂誘導油紅油紅o o染色染色b b誘導后充脂細胞明顯增多誘導后充脂細胞明顯增多（100） 脂滴融合脂滴融合, 胞核位于細胞一側胞核位于細胞一側（200） 誘導后的脂肪細胞經油紅誘導后的脂肪細胞經油紅o o染色后染色后, ,脂滴呈紅色脂滴呈紅色成脂誘導成脂誘導脂肪細胞標志基因表達脂肪細胞標志基因表達b b0260.00.20.40.60.8abcd14ppar- mrn

21、a表達豐度表達豐度誘導天數誘導天數ppar595 bp-actin 399 bp成脂誘導成脂誘導 由上述結果可以看出，豬脂肪間充質干細胞在地塞由上述結果可以看出，豬脂肪間充質干細胞在地塞米松、胰島素、吲哚美辛等的誘導作用下，細胞形態(tài)發(fā)米松、胰島素、吲哚美辛等的誘導作用下，細胞形態(tài)發(fā)生變化，由長梭形變?yōu)槌錆M脂滴的脂肪細胞。油紅生變化，由長梭形變?yōu)槌錆M脂滴的脂肪細胞。油紅o o染色染色和和 rt-pcrrt-pcr均表明可以誘導分化脂肪細胞。均表明可以誘導分化脂肪細胞。成脂誘導成脂誘導 研究表明，脂肪細胞由中胚層間充質干細胞發(fā)育而來，研究表明，脂肪細胞由中胚層間充質干細胞發(fā)育而來，近近30多年來對

22、脂肪細胞的研究主要使用的是鼠源性前體脂肪多年來對脂肪細胞的研究主要使用的是鼠源性前體脂肪細胞系和原代前體脂肪細胞。但是這兩者都是已經定向的單細胞系和原代前體脂肪細胞。但是這兩者都是已經定向的單能細胞，只能分化為成熟的脂肪細胞，因此這兩個體外培養(yǎng)能細胞，只能分化為成熟的脂肪細胞，因此這兩個體外培養(yǎng)體系的研究只能局限于前體脂肪分化為成熟脂肪細胞這一階體系的研究只能局限于前體脂肪分化為成熟脂肪細胞這一階段的細胞和分子事件。段的細胞和分子事件。豬豬amsc細胞系建立的初步研究細胞系建立的初步研究 因此，因此，amscs細胞系的建立可為研究脂肪細胞分化細胞系的建立可為研究脂肪細胞分化全過程，探討脂肪細胞

23、分化早期細胞與分子事件提供新的全過程，探討脂肪細胞分化早期細胞與分子事件提供新的研究模型。研究模型。 本實驗室在成功分離豬原代本實驗室在成功分離豬原代amsc細胞后，細胞單克細胞后，細胞單克隆擴增方法獲得單一來源的隆擴增方法獲得單一來源的amsc細胞，傳細胞，傳20代后細胞形代后細胞形態(tài)一致，經鑒定仍然具有態(tài)一致，經鑒定仍然具有amsc表面標志。表面標志。細胞單克隆擴增培養(yǎng)所有細胞均來源于同一祖細胞，細胞形態(tài)一致cd105cd4424代細胞表面代細胞表面marker鑒定鑒定 目前我們正在對保存的細胞進行染色體核目前我們正在對保存的細胞進行染色體核型分析，支元體檢測等工作。型分析，支元體檢測等工

24、作。 現有的研究表明，脂肪組織是一個易獲取和儲量豐富的成體現有的研究表明，脂肪組織是一個易獲取和儲量豐富的成體干細胞庫。干細胞庫。amscs取材容易，創(chuàng)傷小，具有可控制的多向分化能取材容易，創(chuàng)傷小，具有可控制的多向分化能力，對于組織工程來說，幾乎是個力，對于組織工程來說，幾乎是個“完美完美”的細胞；且細胞培養(yǎng)、的細胞；且細胞培養(yǎng)、擴增較容易，易獲得大量可供自體或異體移植使用的干細胞；在擴增較容易，易獲得大量可供自體或異體移植使用的干細胞；在急、慢性骨、軟骨組織損傷，肌組織缺損、矯形手術、中樞神經急、慢性骨、軟骨組織損傷，肌組織缺損、矯形手術、中樞神經系統損傷及其它領域有潛在應用價值。系統損傷及

25、其它領域有潛在應用價值。 五、五、amsc應用前景及待解決的問題應用前景及待解決的問題 但若將該細胞應用于臨床，仍需在動物模型上進行但若將該細胞應用于臨床，仍需在動物模型上進行大量安全性和有效性的實驗。盡管大量安全性和有效性的實驗。盡管amscs實際應用過程實際應用過程中仍存在一些需要解決的問題，如體外培養(yǎng)是一種優(yōu)化中仍存在一些需要解決的問題，如體外培養(yǎng)是一種優(yōu)化過的環(huán)境，而體外培養(yǎng)后的過的環(huán)境，而體外培養(yǎng)后的amscs能否適應體內環(huán)境而能否適應體內環(huán)境而繼續(xù)生長分化；在體內繼續(xù)生長分化；在體內amscs分化控制過程中能否排除分化控制過程中能否排除致瘤性風險及是否發(fā)生免疫紊亂等。致瘤性風險及是

26、否發(fā)生免疫紊亂等。 另外，種子細胞最終移入體內還需有合適的生物另外，種子細胞最終移入體內還需有合適的生物材料作載體，這種載體必須具有生物相容性，并可生材料作載體，這種載體必須具有生物相容性，并可生物降解，易于生長因子等促細胞分化和組織形成的分物降解，易于生長因子等促細胞分化和組織形成的分子物質的連接和輸送，易于生產和使用。目前關于生子物質的連接和輸送，易于生產和使用。目前關于生物載體的研究相對較少，因此，特異性組織生物材料物載體的研究相對較少，因此，特異性組織生物材料也將是一個重要而廣闊的研究領域。也將是一個重要而廣闊的研究領域。 但相信有關但相信有關amscs的研究仍然前景廣闊，脂肪組織的研

27、究仍然前景廣闊，脂肪組織來源的來源的amscs未來極有可能會取代目前的干細胞源而成未來極有可能會取代目前的干細胞源而成為組織工程、基因治療的一個新的熱點，并能解決一系為組織工程、基因治療的一個新的熱點，并能解決一系列臨床難題而具有良好的應用前景。列臨床難題而具有良好的應用前景。 鑒于脂肪源性干細胞強大的鑒于脂肪源性干細胞強大的“可塑性可塑性”、容、容易獲得、免疫排斥小等優(yōu)點，國外一些公司和研易獲得、免疫排斥小等優(yōu)點，國外一些公司和研究機構等紛紛謀求究機構等紛紛謀求脂肪間充質干細胞脂肪間充質干細胞成為組織工成為組織工程或細胞治療新的同種異體種子細胞來源，并申程或細胞治療新的同種異體種子細胞來源，

28、并申請了相關專利。請了相關專利。 2004年年12月月16日日macropore biosurgery公司（法公司（法蘭克福）與蘭克福）與giessen大學聯合對外公布使用大學聯合對外公布使用脂肪間充質脂肪間充質干細胞干細胞治療一名七歲女孩顱骨缺損的臨床報告，為該治療一名七歲女孩顱骨缺損的臨床報告，為該領域今后的工作奠定了基石。通過對歐洲專利局世界領域今后的工作奠定了基石。通過對歐洲專利局世界專利數據庫檢索，專利數據庫檢索，2005年年1月月5日前已經公開的關于日前已經公開的關于脂脂肪源性干細胞肪源性干細胞的基本專利共有的基本專利共有14項，顯示出項，顯示出脂肪間充脂肪間充質干細胞質干細胞潛在的市場價值。潛在的市場價值。 專利號及相關專利專利號及相關專利 專利名稱專利名稱 ep1453954 us2003124721，wo03039489 脂肪干細胞分化成內分泌胰腺及其用途us2003166278 us6555374、ca2316400 脂肪干細胞的多重中胚層細胞系分化 潛能及其應用 wo03080801 分離的脂肪干細胞用于治療心功能衰竭、帕金森疾 病、糖尿病、貧血癥和地中海貧血us2004092011 脂肪基質分化成成人脂肪干細胞及其用途 wo03