微生物限度方法學(xué)驗(yàn)證

1、微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證一、檢驗(yàn)方法依據(jù)微生物計(jì)數(shù)法（中國(guó)藥典2015年版四部1105）；控制菌檢查法（中國(guó)藥典2015年版四部1106）；非無菌藥品微生物限度標(biāo)準(zhǔn)（中國(guó)藥典2015年版四部1107）；抑菌效力檢查法（中國(guó)藥典2015年版四部1121）檢查。二、菌種、培養(yǎng)基及稀釋液表1菌種菌種名稱菌種代數(shù)菌種狀態(tài)廠家大腸埃希菌 CMCC(B)441023正常浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院金黃色葡萄球菌CMCC(B)260033正?？莶菅挎邨U菌CMCC(B)635013正常白色念珠菌CMCC(F)980013正常黑曲霉CMCC(F)980033正常乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)500943正常表2培養(yǎng)

2、基培養(yǎng)基名稱批號(hào)廠家營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基150222北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁培養(yǎng)基150134北京三藥科技開發(fā)公司改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基150215北京三藥科技開發(fā)公司營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基150317北京三藥科技開發(fā)公司玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基150323北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽乳糖培養(yǎng)基150127北京三藥科技開發(fā)公司膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基150214北京三藥科技開發(fā)公司四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基150416北京三藥科技開發(fā)公司MUG培養(yǎng)基150122北京三藥科技開發(fā)公司曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基150137北京三藥科技開發(fā)公司三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基150207北京三藥科技開發(fā)公司表3對(duì)照用培養(yǎng)基對(duì)照培養(yǎng)基名稱批號(hào)廠家營(yíng)養(yǎng)肉湯對(duì)照

3、培養(yǎng)基135004-201103中國(guó)食品藥品檢定研究院營(yíng)養(yǎng)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基135003-201002中國(guó)食品藥品檢定研究院玫瑰紅鈉瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基135005-201002中國(guó)食品藥品檢定研究院膽鹽乳糖對(duì)照培養(yǎng)基135006-201404中國(guó)食品藥品檢定研究院膽鹽硫乳瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基135010-201102中國(guó)食品藥品檢定研究院四硫磺酸鈉亮綠對(duì)照培養(yǎng)基135020-201101中國(guó)食品藥品檢定研究院MUG對(duì)照培養(yǎng)基135012-201001中國(guó)食品藥品檢定研究院曙紅亞甲藍(lán)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基135009-201102中國(guó)食品藥品檢定研究院三糖鐵瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基表4試劑試劑名稱批號(hào)級(jí)別磷酸二氫鉀130826

4、分析純氫氧化鈉20150117分析純氯化鈉20140714分析純聚山梨酯8020141011化學(xué)純95%乙醇15070722藥用級(jí)二甲氨基苯甲醛20140402分析純鹽酸20140533分析純稀釋液：（1）pH6.8緩沖液 取0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液250ml,加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118ml,用水稀釋至1000ml，搖勻，既得。（2）0.9%無菌氯化鈉溶液取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝、滅菌。（3）0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9無菌氯化鈉溶液溶解并稀釋至1000ml，濾過，分裝，滅菌，備用。

5、（4）靛基質(zhì)試液 取對(duì)二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振搖，使完全溶解后，取鹽酸20ml徐徐滴入。三、菌液的制備1細(xì)菌、霉菌、酵母菌接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48小時(shí)。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50100cfu的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7天，加入5ml含0.05（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液（用帶有無菌棉花的能過濾菌絲的無菌毛細(xì)吸管）用0.9%

6、無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數(shù)50100cfu的孢子懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28可在24小時(shí)內(nèi)使用。2控制菌接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌、金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時(shí)。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10100cfu的菌懸液。菌懸液在室溫下放置應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用，若保存在28可在24小時(shí)內(nèi)使用。四、驗(yàn)證內(nèi)容1、計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證將制備好的菌懸液用0.9%無菌氯化鈉溶液以每10倍體積分別稀釋成一系列濃度菌懸液，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，確定具體菌懸液濃度，取接近于10cfu-100cfu的稀釋濃度，選取各項(xiàng)試驗(yàn)項(xiàng)下的規(guī)定濃度進(jìn)

7、行實(shí)驗(yàn)。稀釋及觀察均應(yīng)在陽性室內(nèi)完成。經(jīng)過驗(yàn)證當(dāng)原液稀釋至10-6時(shí)，菌液濃度接近100cfu/ml。2、適用性檢查2.1細(xì)菌、霉菌、酵母菌取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各1ml(內(nèi)含菌約50100cfu)，分別注入無菌平皿中，立即傾注營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)；取白色念珠菌、黑曲霉1ml(內(nèi)含菌約50100cfu)，注入無菌平皿中（取用黑曲霉時(shí)應(yīng)注意自身安全），立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置2328培養(yǎng)72小時(shí)，計(jì)數(shù)。同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)，作為對(duì)照。其大

8、小、形態(tài)應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致，且數(shù)量應(yīng)不小于對(duì)照培養(yǎng)基的70%。細(xì)菌、霉菌及酵母菌培養(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱菌種名稱測(cè)試培養(yǎng)基（cfu）對(duì)照培養(yǎng)基（cfu）回收率(%)大小形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)論碟1碟2平均碟1碟2平均營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌87838595999787.6一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌88828594989688.5一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定大腸埃希菌838684.595959588.9一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌848785.5999496.588.6一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定金黃色葡萄球菌908688

9、971019988.9一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定大腸埃希菌888385.5929995.589.5一致大小形態(tài)一致且回收率70%符合規(guī)定培養(yǎng)基中細(xì)菌、霉菌、酵母菌的生長(zhǎng)情況良好，回收率在80%，且與對(duì)照培養(yǎng)基狀態(tài)一致，證明此批次培養(yǎng)基可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出相應(yīng)微生物情況。2.2控制菌2.2.1促生長(zhǎng)能力取大腸埃希菌菌懸液0.1ml（內(nèi)含菌約10100cfu），分別置于膽鹽乳糖培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中；取乙型副傷寒沙門菌0.1ml（內(nèi)含菌約10100cfu），分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，取乙型副傷寒沙門菌0.1ml（內(nèi)含菌約10100cfu）涂布于膽鹽硫乳

10、瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基中；于35培養(yǎng)18小時(shí)，同時(shí)，用相應(yīng)的對(duì)照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗(yàn)，作為對(duì)照，每個(gè)培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。膽鹽乳糖培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MUG培養(yǎng)基與對(duì)照管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌應(yīng)生長(zhǎng)良好；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基與對(duì)照培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征應(yīng)一致。2.2.2抑制能力取金黃色葡萄球菌100 cfu左右，注入無菌平皿中，立即傾注膽鹽乳糖培養(yǎng)基、四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置35培養(yǎng)18小時(shí)，應(yīng)不得有菌生長(zhǎng)。2.2.3指示能力取乙型副傷寒沙門菌10100cfu，接種于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基中，每個(gè)培養(yǎng)

11、基平行制備2個(gè)平皿，混勻，凝固，置3035培養(yǎng)18小時(shí)；膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基、曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基指示能力見2.2.1中乙型副傷寒沙門菌測(cè)試結(jié)果，MUG培養(yǎng)基指示能力見2.2.1中大腸埃希菌測(cè)試結(jié)果。與對(duì)照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反映情況等應(yīng)與對(duì)照培養(yǎng)基一致?？刂凭囵B(yǎng)基適用性檢查培養(yǎng)基名稱促生長(zhǎng)性（與對(duì)照比較）抑制性（與對(duì)照比較）金黃色平葡萄球菌指示性（與對(duì)照比較）乙型副傷寒沙門菌結(jié)論菌種名稱形態(tài)大小形態(tài)大小指示反應(yīng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致無生長(zhǎng)-符合規(guī)定MUG培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致-一致一致一致符合規(guī)定營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基大腸埃希菌一致一致-符合規(guī)

12、定乙型副傷寒沙門菌一致一致-符合規(guī)定四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致無生長(zhǎng)-符合規(guī)定膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致-一致一致一致符合規(guī)定曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基乙型副傷寒沙門菌一致一致-一致一致一致符合規(guī)定三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基-一致一致一致符合規(guī)定培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)性及指示性菌落生長(zhǎng)狀態(tài)一致，抑制性均無菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基適用性良好。3、抑菌性：取連續(xù)生產(chǎn)的三批樣品進(jìn)行測(cè)定3.1細(xì)菌 、霉菌、酵母菌3.1.1供試液的制備：稱取本品10g，加pH6.8緩沖液100ml，混勻，制成1：10的供試液。3.1.2試驗(yàn)組：取大腸埃希菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和枯草芽孢桿菌菌懸液各1ml，

13、分別加上述供試液1ml，注入平皿中，立即傾注1520ml溫度不超過45溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。31.3菌液組：取上述各試驗(yàn)菌液1ml，加入相應(yīng)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌數(shù)。3.1.4供試品對(duì)照組：取供試液1ml，分別注入1520ml溫度不超過45溶化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個(gè)培養(yǎng)基平行制備2個(gè)平皿。3.1.5回收率標(biāo)準(zhǔn)以供試品對(duì)照組為樣品空白(C0)、以菌液組為對(duì)照(T)、以試驗(yàn)組為測(cè)試品(C)計(jì)：(C-C0)/T70%細(xì)菌、霉菌及酵母菌抑菌性檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)批號(hào)培養(yǎng)基名稱菌種培養(yǎng)時(shí)間（h）菌液組

14、菌數(shù)Cfu試驗(yàn)組菌數(shù)Cfu供試品對(duì)照組菌數(shù)回收率%數(shù)值平均數(shù)值平均數(shù)值平均150804營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7284869092.581095.9728895金黃色葡萄球菌7286849391.597.072829012大腸埃希菌728485.5919295.9728793玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌1208686.584850098.31208786金黃色葡萄球菌1208787.5858698.312088870大腸埃希菌1208785.5838397.11208483150805營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌7288859592.56597.1728690金黃色葡萄球菌728584.5959

15、3.595.57284924大腸埃希菌728184.58991.597.7728794玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌12083858787.50097.11208788金黃色葡萄球菌12086848886.597.112082850大腸埃希菌1208884868895.51208090150806營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌728785.59495.56695.5728497金黃色葡萄球菌728386969695.67289966大腸埃希菌728585.5959695.0728697玫瑰紅鈉培養(yǎng)基枯草芽孢桿菌120848485870096.61208489金黃色葡萄球菌1208585.5908996

16、.112086880大腸埃希菌1208283.5898796.01208585 通過連續(xù)三批次不同種菌類的加樣，回收率均在90%以上，說明本產(chǎn)品對(duì)于細(xì)菌、霉菌及酵母菌不具備抑菌性。3.2控制菌3.2.1大腸埃希菌取10 ml供試液（制備方法同3.1.1）及大腸埃希菌菌懸液1ml(10100cfu)加入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml，于35培養(yǎng)24小時(shí)。取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時(shí)、24小時(shí)在366nm紫外燈下觀察，同時(shí)用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對(duì)照。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液。紫外燈照射時(shí)管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性；不呈現(xiàn)熒光，為

17、MUG陰性；加入靛基質(zhì)試液時(shí)液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。3.2.2沙門氏菌取10 ml供試液（制備方法同3.1.1）及乙型副傷寒沙門菌1ml(10100cfu)，直接接種至200ml的營(yíng)養(yǎng)肉湯培 養(yǎng)基中，混勻，于35培養(yǎng)培養(yǎng)24小時(shí)，取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，35培養(yǎng)24小時(shí)后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基和曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基的平板上，35培養(yǎng)24小時(shí)。3.3合格標(biāo)準(zhǔn)若上述試驗(yàn)檢測(cè)出試驗(yàn)菌，則按此供試液制備方法和控制菌檢查方法進(jìn)行供試品的該控制菌檢查?？刂凭志詸z查大腸埃希菌試驗(yàn)組（+/-）陰性對(duì)照組（+/-）MUG+ +- -靛基質(zhì)+ +- -沙門氏菌試驗(yàn)組（+/-）陰性對(duì)照組（+/-）四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基+ +- -膽鹽硫乳瓊脂培養(yǎng)基 + +- -曙紅亞甲藍(lán)瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基+ +- -三糖鐵瓊脂對(duì)照培養(yǎng)基+ +- -經(jīng)控制菌的驗(yàn)證，當(dāng)樣品被1:10稀釋時(shí)，本品不具有抑菌性，可以直接采用平皿法進(jìn)行檢驗(yàn)而不對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成假陰性的影響。五、本品微生物限度檢查方法的確定綜上所述，本品細(xì)菌、霉菌及酵母菌檢查采用常規(guī)平皿法，取1：10稀釋級(jí)供試