顯微操作技術(shù)熒光顯微鏡技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用

1、熒光顯微鏡技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用熒光顯微鏡技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用 透射式透射式落射式落射式 和傳統(tǒng)顯微技術(shù)相比和傳統(tǒng)顯微技術(shù)相比,熒光顯微技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)熒光顯微技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):(1)(1)熒光顯微鏡所用光源的波長(zhǎng)比傳統(tǒng)顯微鏡光源的熒光顯微鏡所用光源的波長(zhǎng)比傳統(tǒng)顯微鏡光源的波長(zhǎng)短波長(zhǎng)短1/2,1/2,因此熒光顯微鏡的分辨能力超出了傳因此熒光顯微鏡的分辨能力超出了傳統(tǒng)顯微鏡的分辨率的極限統(tǒng)顯微鏡的分辨率的極限(2)(2)熒光顯微鏡技術(shù)具有高度靈敏性和專一性熒光顯微鏡技術(shù)具有高度靈敏性和專一性. .它所它所用染料的量是極其微小的用染料的量是極其微小的, ,只相當(dāng)于傳統(tǒng)顯微技術(shù)只相當(dāng)于傳統(tǒng)顯微技術(shù)中染料消耗量

2、的幾千分之一中染料消耗量的幾千分之一. . (3)(3)熒光顯微鏡能夠直接顯示細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)成熒光顯微鏡能夠直接顯示細(xì)胞內(nèi)的生物化學(xué)成分分, ,并且顯示的彩色效果很明亮并且顯示的彩色效果很明亮, ,極易觀察極易觀察, ,極易進(jìn)極易進(jìn)行定量分析行定量分析, ,而且能以極低濃度的染料檢測(cè)出含量而且能以極低濃度的染料檢測(cè)出含量極微的物質(zhì)極微的物質(zhì). . (4) (4) 隨著新的熒光染料的發(fā)明隨著新的熒光染料的發(fā)明, ,可不斷擴(kuò)大被測(cè)物可不斷擴(kuò)大被測(cè)物質(zhì)的范圍質(zhì)的范圍. . 生物學(xué)材料，有各種產(chǎn)生熒光生物學(xué)材料，有各種產(chǎn)生熒光:1.1.自發(fā)熒光自發(fā)熒光: :或原發(fā)熒光或原發(fā)熒光 細(xì)胞組織中自然存在的

3、某些物質(zhì)可被激發(fā)產(chǎn)細(xì)胞組織中自然存在的某些物質(zhì)可被激發(fā)產(chǎn)生熒光生熒光2.2.誘發(fā)熒光誘發(fā)熒光 材料中的某些物質(zhì)經(jīng)一定的化學(xué)處理后，可材料中的某些物質(zhì)經(jīng)一定的化學(xué)處理后，可轉(zhuǎn)化為熒光色團(tuán)，由此被誘發(fā)產(chǎn)生熒光。最常見(jiàn)轉(zhuǎn)化為熒光色團(tuán)，由此被誘發(fā)產(chǎn)生熒光。最常見(jiàn)的是甲醛誘發(fā)蛋白質(zhì)中所含的芳香乙胺基團(tuán)轉(zhuǎn)化的是甲醛誘發(fā)蛋白質(zhì)中所含的芳香乙胺基團(tuán)轉(zhuǎn)化為熒光色團(tuán)。戊二醛也能誘發(fā)熒光為熒光色團(tuán)。戊二醛也能誘發(fā)熒光 3 3熒光染料染色：熒光染料染色： 應(yīng)用含熒光色團(tuán)的物質(zhì)作為染料，使與生物應(yīng)用含熒光色團(tuán)的物質(zhì)作為染料，使與生物組織中和該物質(zhì)有特殊親和力的成分相結(jié)合，即組織中和該物質(zhì)有特殊親和力的成分相結(jié)合，即可被

4、激發(fā)熒光。這類染料稱為熒光染料或熒色素?？杀患ぐl(fā)熒光。這類染料稱為熒光染料或熒色素。許多常規(guī)染色劑許多常規(guī)染色劑( (如剛果紅、曙紅、堿性品紅、水如剛果紅、曙紅、堿性品紅、水溶性苯胺藍(lán)等溶性苯胺藍(lán)等) )兼有熒光染料的性能兼有熒光染料的性能1.dna1.dna研究研究 用細(xì)胞熒光測(cè)定技術(shù)測(cè)量用細(xì)胞熒光測(cè)定技術(shù)測(cè)量dna,dna,是熒光顯微技術(shù)和是熒光顯微技術(shù)和細(xì)胞光度技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物細(xì)胞光度技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物, ,標(biāo)志著前者由定性向標(biāo)志著前者由定性向定量測(cè)定發(fā)展定量測(cè)定發(fā)展. .吖啶橙吖啶橙 3 3，6 6（二甲胺基）吖啶鹽酸鹽，分子式（二甲胺基）吖啶鹽酸鹽，分子式c17h19n3 c17h19

5、n3 hcl hcl zncl zncl , , 分子量分子量438.12g/mol,438.12g/mol,是一種熒光是一種熒光色素色素，其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)，其檢測(cè)激發(fā)濾光片波長(zhǎng)488nm,488nm,阻斷阻斷濾光片濾光片波長(zhǎng)波長(zhǎng)515nm515nm。 吖啶橙吖啶橙 染色原理染色原理:吖啶橙可對(duì)細(xì)胞中的吖啶橙可對(duì)細(xì)胞中的dnadna和和rnarna同時(shí)染同時(shí)染色而顯示不同顏色的熒光。其激發(fā)峰為色而顯示不同顏色的熒光。其激發(fā)峰為492nm492nm，熒，熒光發(fā)射峰為光發(fā)射峰為530nm530nm（dnadna）、）、640640（rnarna），它與雙），它與雙鏈鏈dnadna的結(jié)合方式是嵌

6、入雙鏈之間，而與單鏈的結(jié)合方式是嵌入雙鏈之間，而與單鏈dnadna和和rnarna則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍(lán)光則由靜電吸引堆積在其磷酸根上。在藍(lán)光（502nm502nm）激發(fā)下，細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光（約）激發(fā)下，細(xì)胞核發(fā)亮綠色熒光（約530nm530nm），胞質(zhì)），胞質(zhì)rnarna發(fā)橘紅色熒光（發(fā)橘紅色熒光（580nm580nm）。）。 它與它與細(xì)胞細(xì)胞中中dnadna和和rnarna結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不結(jié)合量存在差別，可發(fā)出不同顏色的同顏色的熒光熒光，與，與dnadna結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，與結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，與rnarna結(jié)合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有結(jié)合量多發(fā)桔黃色或

7、桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過(guò)細(xì)胞膜，使核膜通透性，能透過(guò)細(xì)胞膜，使核dnadna和和rnarna染色。染色。因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過(guò)正常因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過(guò)正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃綠色均勻熒光。 體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞吖啶橙熒光染色體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞吖啶橙熒光染色可見(jiàn)含可見(jiàn)含dna的細(xì)胞核顯示黃綠色熒光，含的細(xì)胞核顯示黃綠色熒光，含rna的細(xì)胞質(zhì)顯示橘紅色熒光的細(xì)胞質(zhì)顯示橘紅色熒光dapidapi dapidapi即即4,6-4,6-二脒基二脒基-2-2-苯基吲哚苯基吲哚(4,6-(4,6-diamidino-

8、2-phenylindole)diamidino-2-phenylindole)，是一種能夠與，是一種能夠與dnadna強(qiáng)力強(qiáng)力結(jié)合的結(jié)合的熒光染料熒光染料，最大吸收波長(zhǎng)為，最大吸收波長(zhǎng)為358nm358nm，最，最大發(fā)射波長(zhǎng)為大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm461nm。dapidapi染色原理：染色原理： dapi dapi 為一種為一種熒光染料熒光染料，可以穿透細(xì)胞膜與，可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)細(xì)胞核胞核中的雙鏈中的雙鏈dnadna結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比生比dapidapi自身強(qiáng)自身強(qiáng)2020多倍的熒光，和多倍的熒光，和ebeb相比，對(duì)雙鏈相比，對(duì)雙鏈dnadna的染

9、色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到的染色靈敏度要高很多倍。顯微鏡下可以看到顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察顯藍(lán)色熒光的細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞標(biāo)記的效的效率高率高( (幾乎為幾乎為100 %) 100 %) ，且對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒副作用。，且對(duì)活細(xì)胞無(wú)毒副作用。2.2.細(xì)胞壁研究細(xì)胞壁研究 熒光顯微技術(shù)在植物細(xì)胞學(xué)中應(yīng)用的一個(gè)突出熒光顯微技術(shù)在植物細(xì)胞學(xué)中應(yīng)用的一個(gè)突出方面方面, ,是用于鑒定細(xì)胞壁成分是用于鑒定細(xì)胞壁成分, ,研究壁形成和再生研究壁形成和再生, ,以及壁在植物發(fā)育過(guò)程中和環(huán)境影響下性質(zhì)的變化以及壁在植物發(fā)育過(guò)程中和環(huán)境影響下性質(zhì)的變化 觀察細(xì)胞壁的方法很多觀察細(xì)胞壁的方法

10、很多, ,如用專一的染料染色如用專一的染料染色或利用纖維素的偏振光性質(zhì)等?，F(xiàn)在國(guó)外常用的方或利用纖維素的偏振光性質(zhì)等。現(xiàn)在國(guó)外常用的方法是熒光增白劑染色法是熒光增白劑染色, ,在在4qonm4qonm左右的激發(fā)光照射下左右的激發(fā)光照射下觀察細(xì)胞壁觀察細(xì)胞壁( (纖維素纖維素) )所產(chǎn)生的綠色熒光來(lái)判斷細(xì)胞所產(chǎn)生的綠色熒光來(lái)判斷細(xì)胞壁的有無(wú)壁的有無(wú) 熒光增白劑染色熒光增白劑染色 熒光增白劑和細(xì)胞壁成分有強(qiáng)烈親和力熒光增白劑和細(xì)胞壁成分有強(qiáng)烈親和力, ,當(dāng)前常用當(dāng)前常用的熒光增白劑有的熒光增白劑有st,m2r,vbl.stst,m2r,vbl.st開(kāi)始被用于顯示細(xì)開(kāi)始被用于顯示細(xì)菌菌, ,放線菌與

11、真菌的細(xì)胞壁放線菌與真菌的細(xì)胞壁, ,在粘菌材料中在粘菌材料中, ,它被證它被證明與纖維素和幾丁質(zhì)有親和力明與纖維素和幾丁質(zhì)有親和力 胼胝質(zhì)是一種以胼胝質(zhì)是一種以-1,3-1,3鍵結(jié)合的葡聚糖。在植物鍵結(jié)合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其合成、分解直接關(guān)系植物正常要的調(diào)節(jié)作用，其合成、分解直接關(guān)系植物正常的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。 胼胝質(zhì)是一種以胼胝質(zhì)是一種以-1,3-1,3鍵結(jié)合的葡聚糖。在植物鍵結(jié)合的葡聚糖。在植物的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重的篩管代謝、配子體發(fā)育等生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的

12、調(diào)節(jié)作用，其合成、分解直接關(guān)系植物正常要的調(diào)節(jié)作用，其合成、分解直接關(guān)系植物正常的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。 3 3細(xì)胞生活力測(cè)定細(xì)胞生活力測(cè)定 熒光素?zé)晒馑仉p醋酸酯（雙醋酸酯（fdafda）是一種常用的培養(yǎng)動(dòng)）是一種常用的培養(yǎng)動(dòng)植物細(xì)胞植物細(xì)胞以以及及植物細(xì)胞植物細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體的生活力鑒定染料，其染色機(jī)理也利的生活力鑒定染料，其染色機(jī)理也利用了死活細(xì)胞在代謝上的差異：用了死活細(xì)胞在代謝上的差異：fdafda本身不產(chǎn)生熒光，也本身不產(chǎn)生熒光，也無(wú)極性，能自由滲透出入完整的細(xì)胞膜。當(dāng)無(wú)極性，能自由滲透出入完整的細(xì)胞膜。當(dāng)fdafda進(jìn)入活細(xì)進(jìn)入活細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的脂酶分解，生成有極性的

13、、能產(chǎn)生熒光胞后，被細(xì)胞內(nèi)的脂酶分解，生成有極性的、能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)的物質(zhì)熒光素?zé)晒馑?，該物質(zhì)不能自由透過(guò)活的細(xì)胞膜，積，該物質(zhì)不能自由透過(guò)活的細(xì)胞膜，積累在細(xì)胞膜內(nèi)，因而使有活力的細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光；而無(wú)累在細(xì)胞膜內(nèi)，因而使有活力的細(xì)胞產(chǎn)生綠色熒光；而無(wú)活力的細(xì)胞因不能使活力的細(xì)胞因不能使fdafda分解，而無(wú)法產(chǎn)生熒光分解，而無(wú)法產(chǎn)生熒光 活體染色活體染色vital staining 將無(wú)毒或毒性較小的某種染料注入動(dòng)物體內(nèi),可被機(jī)體內(nèi)某些組織或細(xì)胞所攝取,稱為活體.影響熒光的因素影響熒光的因素1. ph1. ph的影響的影響 帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多數(shù)芳香族化合物帶有酸性或堿性官能團(tuán)的大多

14、數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液的熒光一般都與溶液phph值有關(guān)，例如：在值有關(guān)，例如：在ph=7-12ph=7-12的溶液中苯胺以分子形式存在，會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光；的溶液中苯胺以分子形式存在，會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光；而在而在ph2ph13ph13的溶液中苯胺以離子形式存在，的溶液中苯胺以離子形式存在，都不會(huì)發(fā)出熒光。都不會(huì)發(fā)出熒光。 同時(shí)所用酸的種類也影響熒光的強(qiáng)度，例如：同時(shí)所用酸的種類也影響熒光的強(qiáng)度，例如：奎寧在硫酸溶液中的熒光比在鹽酸中的要強(qiáng)?？鼘幵诹蛩崛芤褐械臒晒獗仍邴}酸中的要強(qiáng)。2.2.溫度的影響溫度的影響 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響較敏感。溶液溫度下降溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響較敏感。溶液溫度下降時(shí)，

15、介質(zhì)的粘度增大，熒光物質(zhì)與分子的碰撞也隨時(shí)，介質(zhì)的粘度增大，熒光物質(zhì)與分子的碰撞也隨之減少，去活化過(guò)程也減少，則熒光強(qiáng)度增加。相之減少，去活化過(guò)程也減少，則熒光強(qiáng)度增加。相反，隨著溫度上升，熒光物質(zhì)與分子的碰撞頻率增反，隨著溫度上升，熒光物質(zhì)與分子的碰撞頻率增加，使去活化幾率增加，則熒光強(qiáng)度下降。加，使去活化幾率增加，則熒光強(qiáng)度下降。3.3.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系 在稀溶液中：在稀溶液中： f fkckc f f 為熒光強(qiáng)度為熒光強(qiáng)度 k-k-檢檢測(cè)效率（由儀器決定）測(cè)效率（由儀器決定） c c 為液體的濃度高濃度時(shí)，為液體的濃度高濃度時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)生熄滅和自吸收現(xiàn)象

16、，使熒光物質(zhì)發(fā)生熄滅和自吸收現(xiàn)象，使f f與與c c不呈線不呈線性關(guān)系性關(guān)系4猝滅劑猝滅劑 何為猝滅何為猝滅? ? 由于某些原因使發(fā)光材料發(fā)生非輻射躍遷，從由于某些原因使發(fā)光材料發(fā)生非輻射躍遷，從而降低了發(fā)光效率的現(xiàn)象叫做猝滅而降低了發(fā)光效率的現(xiàn)象叫做猝滅 在熒光物質(zhì)溶液中在熒光物質(zhì)溶液中, ,加入某種化合物加入某種化合物, ,使溶液的使溶液的熒光強(qiáng)度顯著降低熒光強(qiáng)度顯著降低, ,這種化合物稱為猝滅劑這種化合物稱為猝滅劑 猝滅作用可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子猝滅作用可能是由于一部分熒光物質(zhì)分子m m與猝滅與猝滅劑劑q q作用而生成了配合物作用而生成了配合物mq,mq,如配合物如配合物mqmq的形成是