目的基因的連接與轉(zhuǎn)化

1、分類及原理分類及原理分類分類： 根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生的末端根據(jù)限制性內(nèi)切酶酶切后產(chǎn)生的末端的類型，分為非互補(bǔ)突出末端的連接、相的類型，分為非互補(bǔ)突出末端的連接、相同粘性末端的連接、平末端連接同粘性末端的連接、平末端連接DNADNA連接示意圖連接示意圖載體自連及去磷酸化載體自連及去磷酸化常用堿性磷酸酶常用堿性磷酸酶BAP（大腸桿菌）CIAP(小牛腸)分子量 80,000溫度 60 65最適PH8.0熱穩(wěn)定性好，100 暫時(shí)性失活，室溫放置可恢復(fù)活性，苯酚完全失活分子量 100,000溫度 37 最適PH10.0附近（高底物濃度）PH 8.0附近（低底物濃度）6530分鐘處理99的活性不可逆

2、失活，隨具體條件改變有變動(dòng)，完全失活苯酚處理本實(shí)驗(yàn)連接材料及連接本實(shí)驗(yàn)連接材料及連接體系體系連接示意圖連接示意圖連接體系連接體系載體DNA 17 ng目的DNA 50 ng連接緩沖液（5） 1.2 ul用蒸餾水稀釋至6ul附注：附注：目的DNA的總體積是3ul，如果不夠總質(zhì)量以總體積為準(zhǔn)1. 1. 載體和插入片段的摩爾濃度比載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可載體和插入片段的摩爾濃度比載體：插入片段的摩爾數(shù)的變化范圍可為為8 8：1 1到到1 1：1616，但通常的變化范圍是，但通常的變化范圍是3 3：1 1到到1 1：3 3。插入片段的長度。插入片段的長度和序列的變化會(huì)影響和同一載體的連接效果

3、。每一個(gè)連接反應(yīng)都需要和序列的變化會(huì)影響和同一載體的連接效果。每一個(gè)連接反應(yīng)都需要作實(shí)驗(yàn)，來選擇最佳的載體和插入片段的摩爾數(shù)比。在最小的反應(yīng)體作實(shí)驗(yàn)，來選擇最佳的載體和插入片段的摩爾數(shù)比。在最小的反應(yīng)體積中，通常一個(gè)連接反應(yīng)用積中，通常一個(gè)連接反應(yīng)用10-50ng10-50ng的載體的載體DNADNA。2. 2. 進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)的保溫的時(shí)間和溫度也需優(yōu)化。一般而言，平末端連進(jìn)行連接反應(yīng)時(shí)的保溫的時(shí)間和溫度也需優(yōu)化。一般而言，平末端連接在接在2222保溫保溫4-164-16小時(shí)，粘性末端在小時(shí)，粘性末端在2222保溫保溫3 3小時(shí)，或小時(shí)，或1616保溫保溫1616小時(shí)。大多數(shù)連接反應(yīng)用小時(shí)。大

4、多數(shù)連接反應(yīng)用T4DNAT4DNA連接酶，但大腸桿菌的連接酶，但大腸桿菌的DNADNA連接酶可用連接酶可用于粘性末端的連接，平末端連接時(shí)用此酶，活力較低。于粘性末端的連接，平末端連接時(shí)用此酶，活力較低。 3. 3. 載體和插入片段的純度應(yīng)較高，融解的溶劑最好使用滅菌的雙蒸水而載體和插入片段的純度應(yīng)較高，融解的溶劑最好使用滅菌的雙蒸水而不是不是TETE，畢竟，畢竟TETE中含有離子，可能影響連接反應(yīng)。中含有離子，可能影響連接反應(yīng)。感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞的制備HanahanHanahan法是制備高效感受態(tài)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。法是制備高效感受態(tài)細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。這種化學(xué)方法制備的感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率可

5、達(dá)到這種化學(xué)方法制備的感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到10109 9 cfu/ cfu/g DNAg DNA。注：注：1.1.低溫培養(yǎng)，低溫培養(yǎng)，1818培養(yǎng)至培養(yǎng)至OD600約為約為0.5； 2.2.超凈臺(tái)無菌操作，低溫操作；超凈臺(tái)無菌操作，低溫操作； 3.3.標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的種類不同同種感受態(tài)的轉(zhuǎn)化率不標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的種類不同同種感受態(tài)的轉(zhuǎn)化率不同，不同質(zhì)粒形態(tài)轉(zhuǎn)化率也不相同。同，不同質(zhì)粒形態(tài)轉(zhuǎn)化率也不相同。轉(zhuǎn)化原理轉(zhuǎn)化原理1. 0的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)；2. 加入DNA

6、，Ca2+又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶（DNase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上；3. 經(jīng)短暫的42熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Mg2+的存在對(duì)DNA的穩(wěn)定性起很大的作用，MgCl2與CaCl2又對(duì)大腸桿菌某些菌株感受態(tài)細(xì)胞的建立具有獨(dú)特的協(xié)同效應(yīng)。二甲基亞砜（DMSO）和二巰基蘇糖醇（DTT）進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生高頻感受態(tài)的程序，大大提高了大腸桿菌的轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化示意圖轉(zhuǎn)化示意圖連接效率的計(jì)算連接效率的計(jì)算連接效率連接效率=轉(zhuǎn)化子數(shù)轉(zhuǎn)化子數(shù)載體質(zhì)量載體質(zhì)量(個(gè)/ ng)轉(zhuǎn)化效率轉(zhuǎn)化效率(個(gè)/ ng)100%載體自連及去磷酸化載體自連及去磷酸化轉(zhuǎn)化原理轉(zhuǎn)化原理1. 0的CaCl2低滲溶液中，使細(xì)胞膨脹，同時(shí)Ca2+使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，使得位于外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶離開所在區(qū)域，這就構(gòu)成了大腸桿菌人工誘導(dǎo)的感受態(tài)；2. 加入DNA，Ca2+又與DNA結(jié)合形成抗脫氧核糖核酸酶（DNase）的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并粘附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上；3. 經(jīng)短暫的42熱脈沖處理后，細(xì)菌細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，隨之出現(xiàn)許多間隙，致使通透性增加，DNA分子便趁機(jī)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Mg2+的存在對(duì)D