堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷的工藝研究

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷的工藝研究(作者：單位：郵編：)作者：張金紅，周晶，宋慧琴，吳志麗【摘要】 目的建立堿水解法提高黃芪藥材中黃芪甲苷收率的最佳工 藝。方法以黃芪甲苷的收率為考察指標(biāo)，采用正交實驗對黃芪甲苷的 提取工藝進(jìn)行優(yōu)選?？疾霳aOH濃度、水解時間及料液比對黃芪甲苷 收率的影響，采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD測定其含 量。結(jié)果NaOH容液的濃度對黃芪甲苷的收率起主要作用，最佳工藝 條件為：NaOH容液的濃度為0.100 mol L-1，室溫靜置水解2 h , 黃芪藥材與堿溶液的料液配比為1 : 12,黃芪甲苷的含量約是未經(jīng)

2、堿 水解組的16.4倍。結(jié)論堿水解法可顯著提高黃芪藥材中黃芪甲苷的 含量。方法簡便易行，實用價值高，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了依據(jù)。【關(guān)鍵詞】堿水解法；黃芪;黃芪甲苷;正交試驗黃芪為豆科植物蒙古黃芪 Astragalus membranaceus(Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao 或膜 莢黃芪 Astragalus membra naceus (Fisch.) Bge的干燥根。黃芪皂苷是黃芪的主要藥效 物質(zhì)之一，黃芪皂苷大部分是以環(huán)黃芪皂醇為苷元的皂苷，黃芪甲苷（astragalosideIV）為其主要成分1，常作為黃芪藥材及其制劑的質(zhì)量控制定量的指

3、標(biāo)。藥理研究表明，黃芪甲苷具有強(qiáng)心護(hù)心、保護(hù) 神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)皮屏障功能、改善血液流變學(xué)、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抗 衰老、抗胃潰瘍等功能，此外，還具有降血壓、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、促進(jìn)胰島 素分泌等作用2。黃芪甲苷雖然藥理作用顯著，但其在黃芪藥材中 的含量很低，提取分離較困難，使其應(yīng)用受到極大的限制。本研究利 用皂化反應(yīng)原理，在NaOH乍用下將環(huán)黃芪醇皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷， 通過正交實驗優(yōu)選黃芪甲苷轉(zhuǎn)化的最佳條件，提高黃芪甲苷的收率， 為黃芪甲苷單體制劑的研制開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)。1儀器與試藥1.1儀器Agile nt 1100 高效液相色譜儀，Alltech 2000ES 型蒸 發(fā)光散射檢測器，AT-330柱溫箱（天

4、津奧特賽恩斯儀器有限公司）， XWK-3A空氣泵（天津市華生分析儀器廠）;SZ-93自動雙重純水蒸餾水 器（上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司）;BP-211D電子分析天平（德國賽多利斯公 司）;KS-600D超聲清洗機(jī)（寧波科生儀器廠）;W2-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上 海申生科技有限公司）；PHS-25型酸度計（杭州亞美電子儀器廠）。1.2試藥黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為 110781-200613）;黃芪藥材（購自天津市藥材公司，批號為 Y0805267, 由天津醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室周曄教授鑒定，符合中國藥典2005年版I部要求）；AB-8型大孔吸附樹脂（南開大學(xué)樹脂廠）;乙腈（天津 康科

5、德科技有限公司，批號：080426）色譜純，氫氧化鈉為分析純； 流動相用水為重蒸水。2方法與結(jié)果2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性實驗色譜柱：Diamonsil C18(4.6 mmx 250 mm5卩m);流動相：乙腈-水(34 : 66);體積流量：1.0 ml -min-1; 柱溫：35 C ;漂移管溫度：105 C;載氣流量：2.5 L - min-1;壓力： 0.4 MPa進(jìn)樣量：10卩l(xiāng)。此色譜條件下，黃芪甲苷色譜峰與樣品中 其他組分色譜峰可達(dá)基線分離，分離度大于1.5，理論塔板數(shù)以黃芪甲苷峰計不低于4 000。2.2黃芪藥材提取液的制備稱取黃芪藥材 200 g,置于圓底燒瓶 中，各次加乙

6、醇量分別為藥材干重的10, 8, 8倍，90 C水浴回流提 取3次，各次回流時間分別為2, 1.5 , 1 h。每次回流后趁熱過濾， 濾液合并濃縮后定容至500 ml，備用。精確吸取上述提取液 5 ml , 按設(shè)定的實驗條件進(jìn)行水解后，調(diào)節(jié)pH至中性，上AB-8型大孔吸附 樹脂，流出液重復(fù)上樣一次，用 3 BV蒸餾水洗脫樹脂，再用4 BV 70 %乙醇洗脫樹脂，收集 70 %乙醇洗脫液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮近 干，用70%乙醇溶解并定容于10 ml量瓶中，過0.45卩m微孔濾膜， 取續(xù)濾液，即得黃芪藥材樣品液。a.黃芪甲苷對照品;b.堿水解前樣 品;c.堿水解后樣品;1.黃芪甲苷圖1黃芪甲苷標(biāo)

7、準(zhǔn)品及黃芪藥材提 取液堿水解前后的HPLC圖2.3方法學(xué)考察2.3.1線性關(guān)系的考察準(zhǔn)確稱取經(jīng)減壓真空干燥至恒重的黃芪甲苷對照品24.7 mg,置于50 ml量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。分別精密吸取黃芪甲苷對照品儲備液0.25 ,0.5 , 1, 2, 4, 6, 8 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度， 分別精密吸取上述溶液各20卩l(xiāng)，注入高效液相色譜儀，按照“ 2.1” 項下色譜條件測定黃芪甲苷的峰面積，以黃芪甲苷進(jìn)樣量(卩g)的自 然對數(shù)值為橫坐標(biāo)(X),以峰面積的自然對數(shù)值為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo) 準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程，Y=1.376 8X+12.8

8、29, r=0.999 8。黃芪甲苷在0.2477.904卩g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。2.3.2精密度實驗精密吸取黃芪甲苷對照品溶液 10卩 l，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣 6次，測定黃芪甲苷峰面積值 RSD為 1.02 % (n=6)，表明儀器的精密度良好。2.3.3穩(wěn)定性實驗取同一份堿水解工藝制備的黃芪藥材供試液， 于0, 2, 4, 8, 12, 24 h分別進(jìn)樣，測定黃芪甲苷峰面積值 RSD為 1.34 % (n=6)，表明黃芪藥材供試液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.3.4重復(fù)性實驗精密吸取6份黃芪藥材提取液各5 ml至50 ml 圓底燒瓶中，按照相同的堿水解工藝條件制備黃芪藥材供試液，測定并

9、計算黃芪甲苷的含量，RSD為1.68 % (n=6)，表明本處理方法制備 黃芪甲苷的重復(fù)性良好。2.3.5加樣回收率實驗取經(jīng)堿水解工藝制備的已知黃芪甲苷含量的供試液2.5 ml至10 ml量瓶中，共9份，每份分別按相當(dāng)于堿 水解后黃芪供試液中黃芪甲苷含量的 80%, 100%, 120%加入黃芪 甲苷對照品溶液，加70%乙醇定容至刻度，過0.45卩m微孔濾膜， 取續(xù)濾液，測定并計算黃芪甲苷的回收率。結(jié)果表明，黃芪甲苷的平均回收率分別為 98.26 %, 100.21 %和 97.53 %, RSD分別為 1.45 %,1.22 %和 1.03 %。2.4正交實驗法優(yōu)化黃芪藥材的堿水解工藝在考察

10、了NaOH濃度，堿水解時間和料液比等單因素對黃芪甲苷轉(zhuǎn)化率影響的基礎(chǔ)上， 對上述因素水平設(shè)計 L9(34)正交實驗，以每克黃芪生藥中含有黃芪 甲苷的量(mg)作為評價指標(biāo)，篩選最佳工藝。各因素水平見表1。表1正交實驗因素水平表L92.4.1正交實驗樣品的制備及測定 精確吸取“2.2 ”中未經(jīng)堿水 解的黃芪提取液5 ml,按表2正交實驗條件進(jìn)行水解后，繼續(xù)按“2.2 ” 項下操作，每次實驗平行2份。照“ 2.1 ”項下色譜條件以外標(biāo)兩點 法對數(shù)方程計算黃芪甲苷的含量。 結(jié)果見表2。表2正交實驗結(jié)果由 表3可知，因素A(NaOH濃度)對黃芪中黃芪甲苷的收率具有顯著性影 響(P 0.05);因素B(

11、水解時間)和因素C(料液比)對黃芪甲苷的收率無 顯著影響。因此，因素A為主要因素，因素B和C為次要因素，該結(jié) 論與直觀分析法是一致的。因此，結(jié)合實際生產(chǎn)，本實驗的最佳搭配 為A3B2C3即濃度0.100 mol L-1的NaOH室溫靜置水解2 h,料液 比為1 : 12。表3方差分析表2.4.2堿水解工藝的驗證實驗為進(jìn)一步考察上述最佳工藝的穩(wěn) 定性及合理性，將藥材量放大10倍，即取相當(dāng)于20 g黃芪藥材的提 取液進(jìn)行實驗，按照該工藝進(jìn)行重復(fù)性實驗3次，隨行進(jìn)行非水解空 白組。結(jié)果見表4。表4最佳工藝驗證實驗結(jié)果由表4可以看出，驗 證實驗中黃芪甲苷的含量均高于正交實驗各組的含量，經(jīng)過最佳堿水解工

12、藝水解后的黃芪甲苷含量比未經(jīng)堿水解組明顯增高，約是未經(jīng)堿 水解的黃芪皂苷樣品中黃芪甲苷含量的 16.4倍，說明本實驗確定的 黃芪皂苷的最佳堿水解工藝穩(wěn)定可行，對于黃芪甲苷的生產(chǎn)具有很大 的實用價值。2.4.3堿水解前后黃芪總皂苷的含量3精密稱取未經(jīng)堿水解和 堿水解后提取所得黃芪皂苷粗品各約 12.5 mg，用無水乙醇超聲溶解 并定容于25 ml量瓶中，過濾，取濾液作為樣品液。精密吸取0.3 ml樣品液，各加無水乙醇至0.5 ml，再分別加入0.5 ml 8%香草醛無水 乙醇試劑，置于冰浴中緩緩加入 5.0 ml 72%(V/V)的硫酸，旋渦混勻 2 min，放入62C水浴中，保溫30 min，

13、取出，置冰浴冷卻10 min , 搖勻，立即于波長540 nm處測定吸光度，隨行試劑空白，測定 3次， 每個樣品平行做3份。 表5堿水解前后黃芪總皂苷的含量由表 5 可以看出，黃芪皂苷堿水解前后黃芪總皂苷的含量變化不大，采用配對t檢驗，兩者的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，尚不能認(rèn)為黃芪總皂苷堿水解 前后的含量有變化。說明該方法不影響黃芪總皂苷的含量， 而是提高 了活性較強(qiáng)的黃芪甲苷的含量。3討論國內(nèi)外學(xué)者1對黃芪中黃芪皂苷作了深入的研究，已分離鑒定 了數(shù)十種黃芪皂苷，其中大多數(shù)皂苷以環(huán)黃芪皂醇為苷元，以配糖體 部分不同而分類，黃芪甲苷糖體 3個位置均連著-OH,其它環(huán)黃芪醇 皂苷的配糖體上連接-OH或-O

14、Ac,本研究的皂化反應(yīng)原理就是將黃芪 中的環(huán)黃芪醇皂苷轉(zhuǎn)化為黃芪甲苷，從而提高黃芪中黃芪甲苷的收率 及藥用價值。在設(shè)計正交實驗之前，本文對黃芪皂苷的水解方法進(jìn)行了篩選，分別采用了加熱回流法和室溫靜置法進(jìn)行黃芪提取液的堿水解，經(jīng)過t檢驗，結(jié)果表明，加熱回流法與室溫靜置水解法對黃芪提取液中黃 芪甲苷的收率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義， 為節(jié)約成本消耗，更適用于工業(yè) 生產(chǎn)的需要，本研究選用了室溫靜置水解法對黃芪提取液進(jìn)行黃芪皂 苷的水解。中國藥典(2005年版)4中對黃芪甲苷含量測定的前處理中， 采用了氨試液洗滌正丁醇萃取液，以使黃芪中黃芪甲苷的含量達(dá)到測 定的要求，但經(jīng)過反復(fù)洗滌，黃芪甲苷的損失率會大大增加，且氨試 液刺激性大。有研究5采用2%氨液90 C水浴回流2 h，用于提高 黃芪中黃芪甲苷的收率，但該法中氨試液濃度較大，且加熱回流消耗 成本高，污染環(huán)境。因此，本研究采用了濃度為0.100 mol L-1氫氧化鈉在室溫靜置堿水解，減少了氨試液對環(huán)境的污染，降低成本消 耗，該操作方法易于在工業(yè)生產(chǎn)中實施?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 余灝，楊勝華.黃芪皂甙分析方法研究近況 J.華西藥 學(xué)雜