分子診斷學(xué)復(fù)習(xí)

1、名詞解釋LDNA測(cè)丿込 基因是遺傳信息的物理和功能單位，含有產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核昔酸序列，即一段 DA序乙 蛋口質(zhì)組（proteome）:源于蛋白質(zhì)（protein ）與 基因組（genome）兩個(gè)詞的雜合，意指一種基因組所表達(dá)的全套蛋口質(zhì)”，即包括 一種細(xì)胞或一個(gè)組織乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。L蛋口質(zhì)組學(xué)（proteomics）:蛋白質(zhì)組學(xué)就是對(duì)機(jī)體或組織或細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和結(jié)構(gòu)功能分析的一個(gè)研究領(lǐng)域?；颍菏且欢螖y帶功能產(chǎn)物信息的DA片段，是控制某種性狀的遺傳單位。4基因組（genome）:是指一個(gè)細(xì)胞或生物體的一套完整的單倍體遺傳物質(zhì)。L基因組學(xué)（Ge

2、no mics）:指對(duì)所有基因進(jìn)行基因組作圖（包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄圖譜，核苜酸序列分析，基因定位和基因功能 分析的一門科學(xué)。L基因擴(kuò)增：定義:指基因拷貝數(shù)增加的現(xiàn)象，基因擴(kuò)增是基因表達(dá)增加的一種重要機(jī)制。7. 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR :利用DA聚合酶催化一對(duì)引物間的特定DNA片段在體外進(jìn)行快速、大量擴(kuò)增的方法，也稱無(wú)細(xì)胞克隆技術(shù)。8. 增色效應(yīng):DNA變性后,雙螺旋解體，堿基堆積不復(fù)存在，螺旋內(nèi)部的堿基暴露，致變性后的DNA對(duì)260nm紫外光的吸光 率明顯增加，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)。9. 熔解溫度：將DNA解鏈達(dá)到50%或0D260達(dá)到最大值的50%寸的溫度，稱為解鏈溫度或熔解溫度。10

3、. 澳化乙錠（ethidium bromide , EB）是一種熒光染料,可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下發(fā)岀紅色熒光。11. 寶虬與靶基因片段兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苜酸，其本質(zhì)是單鏈DNA它決定擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和長(zhǎng)度。12. 短產(chǎn)物片段：的長(zhǎng)度嚴(yán)格限定在 2個(gè)引物鏈的5 端之間，是需要擴(kuò)增的特定片段，以指數(shù)形式擴(kuò)增（2n） o13. 長(zhǎng)產(chǎn)物片段：比兩引物限定區(qū)更長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物,是以原始模板DNA為模板的擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，以倍數(shù)形式擴(kuò)增（2n）。14. 加端PCR （add-PCR）:即讓擴(kuò)增產(chǎn)物的5-末端帶上一段特殊的、滿足需要的DNA順序的PCR15. 原位PCR （ In Situ PCR

4、:在組織細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)，可檢測(cè)岀該特異序列在細(xì) 胞中的存在量和存在部位。16. 逆轉(zhuǎn)錄PCR （ RT-PCR原理：先在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下,以mRNA為模板合成互補(bǔ)的cDNA再用后者為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。vs17. 反向PCR （reverse ORinverse PCR）:是用一對(duì)反向的引物來(lái)擴(kuò)增兩引物以外的（即對(duì)某 一對(duì)引物間）、未知的DNA片段，個(gè)已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進(jìn)行擴(kuò)增。18. 不對(duì)稱PCR （ asymmetric PCR ）原理：最初的10-15個(gè)循環(huán)中的主要產(chǎn)物是雙鏈DA但是，當(dāng)?shù)蜐舛鹊囊镖拗菩砸铮┍缓谋M后，以

5、后的循環(huán)只產(chǎn)生高濃度引物的延伸產(chǎn)物，結(jié)果便產(chǎn)生大量單鏈DNA （ ssDNA）19. 多重PCR （ multiple PCR ）（檢測(cè)一組特定基因序列的存在或缺失）原理和方法：在同一反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，擴(kuò)增同一模板的多個(gè)區(qū)域（相同或不同基因的多個(gè)部位）。如果其中某一區(qū)段缺失，則電泳圖譜上該區(qū)帶就會(huì)消失。20 巢式PCR （ nested PCR ）定義及原理：用兩對(duì) PCR引物擴(kuò)增完整的DNA片段，以提高檢測(cè)的靈敏度和特異性。H 標(biāo)記引物的PCR（ Labelled primers PCR , LP-PCR）:利用同位素、熒光素等對(duì)PCR引物進(jìn)行標(biāo)記，以便直觀檢測(cè)目的基因。22. 實(shí)時(shí)熒

6、光定量PCR在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程，獲得在線描述PCR過(guò)程的動(dòng)力學(xué)曲線，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知核酸進(jìn)行定量分析。23. 絕對(duì)定量（測(cè)定X的分子數(shù)量）：即用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)精確推算待測(cè)的起始模板拷貝數(shù),又稱外標(biāo)法24. 相對(duì)定量（測(cè)定不冋樣木中X的比率）：在一定樣本中,靶分子相對(duì)于參照樣木中該分子的量的變化程度，又稱內(nèi)標(biāo)法。25. 循環(huán)閾值（Ct ）:在PCR擴(kuò)增過(guò)程中,熒光信號(hào)開(kāi)始由本底進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)階段的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，是FQ-PCR定量的理論基礎(chǔ)。26. 熒光共振能量傳遞（FRET）:某熒光標(biāo)記基團(tuán)在激發(fā)光刺激下生成某波長(zhǎng)的發(fā)射光,當(dāng)另一屏蔽基團(tuán)

7、與其距離合適時(shí)，其發(fā)射光將會(huì)被屏蔽基團(tuán)所吸收，并轉(zhuǎn)化為其它波長(zhǎng)的發(fā)射光或熱能，稱之為FRET27. 熒光淬滅：任何引起熒光強(qiáng)度降低甚至消滅的現(xiàn)象。能夠引起該現(xiàn)象的物質(zhì)即熒光淬滅劑。28. 連接酶鏈反應(yīng)（LCR原理：以DNA連接酶將某一 DNA鏈的5 -P與另一相鄰鏈的3 -0H連接為基礎(chǔ)的循環(huán)反應(yīng)。29. 核酸雜交:不同來(lái)源、具有互補(bǔ)序列的單鏈核酸分子，在一定條件下、按堿基配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。30. 核酸雜交技術(shù)：是一種分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。它基于核酸朵交的原理，利用帶標(biāo)記的核酸探針?lè)肿尤z測(cè)具有同源序列的特定DNA或 RNA分子（靶序列），實(shí)現(xiàn)對(duì)靶序列的定性或/和定量分析。31. 核

8、酸變性：某些理化因素導(dǎo)致DNA雙鏈間的氫鍵斷裂成為單鏈的過(guò)程，稱 DNA變性。32. 探針（probe）:核酸雜交技術(shù)中,兩條單鏈之一是待測(cè)序列（DNA或RNA,另外一條單鏈則是帶有可檢測(cè)標(biāo)志的、與待測(cè)序列存在同源性的特異核酸序列，即探針。33. 核酸探針（probes）:是指能與待測(cè)的靶核酸序列互補(bǔ)朵交、序列己知、并且?guī)в锌蓹z測(cè)標(biāo)記的核酸片段。34. CDNA探針:從己構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中篩選和分離的靶基因探針。35. 寡核苜酸探針-oligonucleotide probe :根據(jù)己知基因序列合成的、與靶基因互補(bǔ)的DNA片段（DA探針）。36. 核酸分子雜交：不同來(lái)源的單鏈核酸分子在合適的

9、條件下,根據(jù)堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈雜交體的過(guò)程。37. 熒光原位雜交（fluorescenee in situ hybridization, FISH） _ :是_種利用熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。麗：它通過(guò)熒光標(biāo)記的探針與待測(cè)標(biāo)木的核酸進(jìn)行原位雜交，在熒光顯微鏡下對(duì)雜交信號(hào)的大小、數(shù)目、定位和分布等進(jìn)行分析，從而對(duì)染 色體或基因異常的細(xì)胞、組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)和診斷。3&分子診斷：利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)和方法,直接檢測(cè)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作岀診斷的方法。39. DNA多態(tài)性：在人類基因組中,平均約200對(duì)堿基可發(fā)生一對(duì)變異（稱為中性突變），導(dǎo)致個(gè)體間核昔

10、酸序列的差異。限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：不少 DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)上，酶解該DNA片段就會(huì)產(chǎn)生長(zhǎng)度不同的片段。40. 單基因?。褐敢环N潰傳病的發(fā)牛只受一對(duì)等位基因的控制,他們的潰傳方式遵循孟德?tīng)柗蛛x定律。41. PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（PCR-ARMS）:由于Taq DNA聚合酶缺乏3 5的外切酶活性，不能糾正引物3端的錯(cuò)配，因此對(duì)于Taq酶的擴(kuò)增反應(yīng)，要求3端必須完全正確配對(duì)，以到達(dá)高效擴(kuò)增。42. 寡核廿酸連接實(shí)驗(yàn)（OLA）:設(shè)計(jì)兩個(gè)寡核甘酸相鄰的探針（約20個(gè)核苗酸）其相鄰接的位點(diǎn)正好是已知的突變位點(diǎn)，探針與靶序列雜交后頭尾相接（5- 3方向）。如果探針和靶序列完全互補(bǔ)，D

11、NA連接酶就會(huì)把二探針通過(guò)磷酸二酯鍵共價(jià)連接起來(lái)，如果探針相鄰之處或接近相鄰之處有一個(gè)堿基錯(cuò)配，則連接效率大大降低，連接阻遏43. 溫度梯度凝膠電泳和變性梯度凝膠電泳仃GGE/DGGE）隨著溫度的逐漸升高時(shí)，DNA分子會(huì)呈階梯式逐步發(fā)生解鏈。部分解鏈的雙鏈DNA分子表現(xiàn)岀一種復(fù)雜的分枝構(gòu)像，得其電泳遷移率大大下降。2、DA分子的解鏈程度決定于該分子的解鏈溫度（Tnj），而Tm有強(qiáng)烈的序列依賴性。3、一段DNA片段往往含多個(gè)長(zhǎng)約50 - 300bp不等的“解鏈區(qū)域”，只有較低 Tm的“解鏈區(qū)域的變異才能被可靠地檢測(cè)到。44. 變性高效液相色譜法（DHPLC） : 1、DHPLC勺分離系統(tǒng)：碳-1

12、8烷坯和無(wú)孔PS-DVB微球體組成電中性、疏水性的固定相，TEAA作為“橋分子”使一總被吸附在固定相上，不同濃度的乙氤為流動(dòng)相為2、DHPLC檢測(cè)突變的原理：當(dāng)柱溫50 C時(shí)為非變性分離；當(dāng)70C 柱溫50C時(shí)為部分變性分離。當(dāng)柱溫70 C時(shí)為完全變性分離。45. 錯(cuò)配接合蛋口質(zhì)截短測(cè)試法（PTT）:以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板從頭合成蛋白質(zhì)從而篩尋該基因的終止密碼，包括三個(gè)主要步驟：1、提取基因組DNA及PCRT增靶基因，或提取RNA通過(guò)RT- PCR得到靶基因。2、以PCR產(chǎn)物為模板轉(zhuǎn)錄岀RNA然后翻譯成蛋口質(zhì)。3、采用SDS-PAGE分析所合成的蛋白質(zhì)，通過(guò)觀察遷移率的變化，區(qū)分基因變異而產(chǎn)生的截短

13、產(chǎn)物與正常的全長(zhǎng)蛋口產(chǎn)物46. 脈沖電場(chǎng)凝膠電泳原理：1、PFGE采用一種正交的交變脈沖電場(chǎng)，在進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，其方向、脈沖時(shí)間和電壓大小可交替改變。一場(chǎng)方向改變時(shí)，DNA分子就要有一定的時(shí)間改變形狀和遷移方向，分子越大，分子構(gòu)型轉(zhuǎn)換所需時(shí)間就越長(zhǎng)，轉(zhuǎn)變遷移方向的時(shí)間也就越長(zhǎng)。3、對(duì)于不同大小的DNA大分子，其改變泳動(dòng)方向所需的時(shí)間不等，遷移速度的快慢也就不等，因此就可以按 DNA分子量大小使其分離開(kāi)來(lái)47. 分子影像探針：分子影像中采用的分子探針是一類標(biāo)記有示蹤劑,能參與體內(nèi)自然的生理生化活動(dòng)的特殊分子。4&生物芯片技術(shù)：采用平而微細(xì)加工技術(shù),將大量生物樣品有序地固化于支持物的表面，組

14、成高度密集的二維生物樣品微陣列（生物芯片），而生物芯片技術(shù)是指通過(guò)平而微細(xì)加工技術(shù)在芯片表而構(gòu)建的微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞、核酸、蛋口質(zhì)及其它生物組分的 快速、敏感、高通量的檢測(cè)分析的技術(shù)。49. 基因芯片：有序地、高密度地排列著大量的基因片段的玻璃片或纖維膜等載體。50. 基因芯片技術(shù)：將大量探針?lè)肿庸潭ㄓ谥С治锷?熒光標(biāo)記的樣品分子按堿基互補(bǔ)原則與探針進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)每個(gè)雜交信號(hào)強(qiáng)度及分 布、進(jìn)而獲取關(guān)于樣品分子的數(shù)量和序列信息，是有利于高通量研究基因表達(dá)、突變等的革命性技術(shù)。51. 蛋口質(zhì)芯片：采用原位合成、機(jī)械點(diǎn)樣或共價(jià)結(jié)合的等方法將各種多肽/蛋白（酶、抗原、抗體等）固定于

15、固相介質(zhì)上形成的蛋白質(zhì)分子點(diǎn)陣，即蛋白質(zhì)芯片，又稱蛋白質(zhì)微陣列。52. 質(zhì)粒（plasmid）:質(zhì)粒是生物體細(xì)胞內(nèi)攜帶的染色體外的核酸分子,能進(jìn)行自主復(fù)制。53. 鏗座壬基因組中存在的不依賴同源性而能移動(dòng)的獨(dú)立的DNA序列，稱為轉(zhuǎn)座子（transposon）,又可稱為轉(zhuǎn)座元件。54. 單順?lè)醋樱杭匆环N基因編碼一種多肽鏈或RNA鏈，每個(gè)基因轉(zhuǎn)錄有各自的調(diào)節(jié)元件。55. 斷裂基因：是指基因的外顯子是不連續(xù)排列的,被內(nèi)含子隔開(kāi)，但按順序鑲嵌在DNA上。斷裂基因兩端起始和終止于外顯子，外顯子和內(nèi)含子交替岀現(xiàn)。56. 基因家族-指由某一祖先基因經(jīng)過(guò)重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因，其核苗酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)

16、具有一定程度的同源性。57. 端粒（telomere ）:真核細(xì)胞的染色體3末端特殊的核蛋口結(jié)構(gòu)。議性和復(fù)制分離：有害突變基因常僅影響部分mtDNA野生型與突變型同時(shí)存在，即為異質(zhì)性；復(fù)制時(shí)隨機(jī)分離導(dǎo)致多態(tài)性不同，即復(fù)制分離。58. 閾值效應(yīng)：當(dāng)突變的mtDNA達(dá)到一定比例，使線粒體總能量供應(yīng)下降到不能維持最低正常功能時(shí)，才引起臨床癥狀。59. 重組DA技術(shù)，又稱分子克隆、基因工程技術(shù)：指在基因水平上,將目的DNA在體外重組于能自我復(fù)制的載體DNA分子上，然后將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行增生，以獲得大量的目的DNA片段，或以此為基礎(chǔ)，通過(guò)基因的誘導(dǎo)表達(dá)，得到大量相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的過(guò)程。60.

17、轉(zhuǎn)化（transformation ）:把帶有目的基因的重組質(zhì)粒DNA引入受體細(xì)胞的過(guò)程。61. 轉(zhuǎn)染（transfection ）:將重組噬菌體DNA直接引入受體細(xì)胞的過(guò)程。62. 轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction ）:若重組噬菌體DNA被包裝到噬菌體頭部成為有感染力的噬菌體顆粒，再以此噬菌體為運(yùn)載體，將頭部重組DNA 導(dǎo)入受體細(xì)胞中的過(guò)程。63主縱子：是指數(shù)個(gè)功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)以及下游的轉(zhuǎn)錄中止信號(hào)所構(gòu)成的基因表達(dá)單 位，所轉(zhuǎn)錄的RNA多為順?lè)醋印?4. 順?lè)醋樱╟isron）:在反式構(gòu)型中不能互補(bǔ)的各突變型所占有的那部分DNA片段。65. 啟動(dòng)子

18、：是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。66. 壇強(qiáng)&位于真核基因中遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)能明顯增強(qiáng)啟動(dòng)子效率的特殊DNA序列。67. 基因表畧是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過(guò)程，合成特定的蛋白質(zhì)，進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功 能和生物學(xué)效應(yīng)的全過(guò)程。68. 分子克?。涸隗w外對(duì)DNA分子按照既定目的和方案進(jìn)行人工重組,將重組分子導(dǎo)入合適宿主，使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖，以獲得該DNA 分子的大量拷貝。69. 載宜能在連接酶的作用下和外源DNA片段連接并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子。70. 感染：以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包

19、裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆 粒，才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。71. 退火：指將溫度降至引物的TM值左右或以下，引物與DNA模板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雜交鏈。72. 基因診斷：以DNA或RNA為診斷材料，通過(guò)檢查基因的存在、結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常，對(duì)人體的狀態(tài)和疾病做岀診斷的方 法和過(guò)程。73. 限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（RFLP）:個(gè)體之間DNA的核苛酸序列存在差異,稱為DNA多態(tài)性。若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長(zhǎng)度和數(shù)量發(fā)生變化，稱RFLPo74. SSCP:單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測(cè)是一種基于DNA構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。相同長(zhǎng)度的單鏈DNA如果堿基序列不同，

20、形成的構(gòu)象就不同，這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。75. 基因文庫(kù)（gene bank）:利用限制性內(nèi)切酶將基因組DA切成片段，每一 DNA片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組DA將所有的重組DNA分子都弓I入到宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為基因文庫(kù)1. DNA測(cè)序2.蛋白質(zhì)組（proteome） 3.蛋口質(zhì)組學(xué)（proteomics） 4.基因組（genome） 5.基因組學(xué)（Genomics） 6.基因擴(kuò)增7.聚合酶鏈反 應(yīng)（PCR 8.增色效應(yīng)9.熔解溫度10.漠化乙錠（ethidium bromide , EB） 11.引物12.短產(chǎn)物片段13.長(zhǎng)產(chǎn)物片段14.加端

21、PCR （ add-PCR）15.原位 PCR （ In Situ PCR ） 16.逆轉(zhuǎn)錄 PCR （ RT-PCR 原理 17.反向 PCR （reverse OR in verse PCR） 18.不對(duì)稱 PCR （ asymmetric PCR ）原理 19.多重 PCR （ multiple PCR ） 20.巢式 PCR （n ested PCR ）定義及原 21.標(biāo)記 引物的 PCR （ Labelled primers PCR , LP- PCR22.實(shí)時(shí)熒光定量PCR23.絕對(duì)定量（測(cè)定X的分子數(shù)量）24.相對(duì)定量（即測(cè)定 不同樣木中X的比率）25.循環(huán)閾值（Ct） 26.熒

22、光共振能 量傳遞（FRET） 27.熒光淬滅28.連接酶鏈反應(yīng)（LCR原理29.核酸雜交30.核酸雜交技術(shù)31.核酸變性32.探針（probe） 33.核酸探針（probes） 34. cDNA探針35.寡核tf酸探針-oligonucleotide probe36.核酸分子朵交37.熒光原位朵交（fluotescenee in situ hybridization, FISH） 38.分子診斷39. DNA多態(tài)性40.單基因病41. PCR擴(kuò)增阻礙突變系統(tǒng)（PCR-ARMS） 42.寡核苗酸連接實(shí)驗(yàn)（0LA） 43.溫度梯度凝膠電泳和變性梯 度凝膠電泳 （TGGE/DGGE） 44.變性高效

23、液相色譜法（DHPLC） 45.錯(cuò)配接合蛋白質(zhì)截短測(cè)試法（PTT） 46.脈沖電場(chǎng)凝膠電泳原理47.分子影像探針48.生物芯片技術(shù)49.基因芯片50.基因芯片技術(shù)51.蛋白質(zhì)芯片52 質(zhì)粒（plasmid） 53.轉(zhuǎn)座子54.單順?lè)?子55.斷裂基因56.基因家族57.端粒（telomere ）58.閾值效應(yīng)59.重組DNA技術(shù)，又稱分子克隆、基因工程技術(shù)60.轉(zhuǎn)化（transformation ） 61.轉(zhuǎn)染（transfection ） 62.轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction ） 63.操縱子 64.順?lè)醋樱╟isron） 65.啟動(dòng)子 66.增強(qiáng) 子 67. 基因表達(dá)68.分子克隆69.載

24、體70.感染71.退火72.基因診斷74. SSCP73.限制性片段長(zhǎng)度的多態(tài)性（RFLP） 75.基因文 庫(kù)（gene bank ）問(wèn)答題一、病毒、原核、真核基因組的特點(diǎn)病毒：（1）病毒基因組小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單。（2）不同病毒基因組可以是不同結(jié)構(gòu)的核酸。（3）基因組相關(guān)基因常從即排列呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄單元。（4）病毒基因組的編碼序列大于90%o （ 5）基因有連續(xù)和間斷的。（6）有基因重疊現(xiàn)象。原核： （1）基因組通常由一條環(huán)狀DNA分子組成。（2）基因組中只有1個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)。（3）基因操縱子結(jié)構(gòu)。（4）編碼序列一般不重疊。（5）基因是連續(xù)的，無(wú)內(nèi)含子，轉(zhuǎn)錄后不需要剪切。（6）編碼區(qū)在基因組中所占的比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)

25、大于真核基因組，但小于病毒基因組。非編碼區(qū)主要是一些調(diào)控序列。（7）基因組中很少有重復(fù)序列。（8）細(xì)菌基因組中存在有可移動(dòng)的DNA序列，包扌舌插入序列和轉(zhuǎn)座子。（9）具有編碼同工酶的基因。（10 ）在DA分子中具有多種功能的識(shí)別區(qū)域。真核：（1）每一種真核生物都有一定的染色體數(shù)目。（2）基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物基因組，具有許多復(fù)制起始點(diǎn)。（3）真核基因都由一個(gè)結(jié)構(gòu)基因與相關(guān)的調(diào)控區(qū)組成，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順?lè)醋?。?）真核生物含有大量重復(fù)序列。（5）真核生物基因組內(nèi)非編碼序列占90%以上。（6）真核基因是斷裂基因。（7）功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族。（8）真核生物基因組中葉存在有一些可移動(dòng)的遺傳因素

26、。二、分子克隆中常用的工具酶及良好載體的條件工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶 功能：識(shí)別特意序列切割 工具酶：多聚核苗酸激酶功 能：是多聚核昔酸5DNA連接酶DNADNA連接DNA片段，使切口封合末端轉(zhuǎn)移酶-末端磷酸化使3疑基加尾聚合酶I合成DNA填補(bǔ)3-末端堿性 磷酸酶切除末端磷酸基逆轉(zhuǎn)錄酶 合成橫cDNA良好載體條件：1必須有自身的復(fù)制子。 2.載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位，即多克隆位點(diǎn)，以供外源DNA插入。3.載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志，以區(qū)別陽(yáng)性重組子和陰性重組子。4.載體分子必須有足夠的容量。5.可通過(guò)特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞。6.對(duì)于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)順

27、序、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)等DNA調(diào)控原件。三、SANGE雙脫氧鏈終止法的原理 在DNA合成時(shí)，利用ddNTP與dNTP競(jìng)爭(zhēng)摻入到新生的DNA鏈上，致鏈延伸反應(yīng)終止。在模板指導(dǎo)和測(cè)序引 物引導(dǎo)下，按堿基配對(duì)原則，聚合酶不斷將dNTPs加到引物的3，-0H末端,使引物延長(zhǎng)，合成岀新的互補(bǔ)的DNA鏈。如果加入ddNTPs,由于雙脫氧核糖的3位置上缺少一個(gè)0H故不能與后續(xù)的的5端 和不同3端的引物延伸鏈的長(zhǎng)短不一的混合物。分辨率的變dNTP形成磷酸二酯鍵，最后每個(gè)反應(yīng)體系中可合成一系列具有相同 各反應(yīng)體系的系列產(chǎn)物的3 末端分別是其相應(yīng)的核苗酸。通過(guò)高性聚丙烯酰胺凝膠電泳（可區(qū)分一個(gè)核苗酸之差）分離和放射

28、自顯影檢測(cè)后，從凝膠底部到頂部按55 3方向讀出新合 成鏈序列，由此推知待測(cè)模板鏈的序列。四、核酸分子雜交的原理具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下（適宜的溫度計(jì)離子強(qiáng)度等）堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈；這一過(guò)程中，核酸分子經(jīng) 歷了變性和復(fù)性的變化，以及在復(fù)性過(guò)程中分子間鍵的形成和斷裂。雜交的雙方是待測(cè)核酸和己知序列。2.五、影響雜交的因素 核酸分子木身：1.核酸分子的大?。悍肿釉酱?，擴(kuò)散速度越慢，單鏈分子間發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)序列的幾率就越小，復(fù)性速度越慢。核酸濃度：越大，復(fù)性速度越快。因?yàn)榛パa(bǔ)鏈相互碰撞的機(jī)會(huì)越大。3.核酸序列的復(fù)雜性序列越簡(jiǎn)單，越容易相互識(shí)別，復(fù)性就越快。反之，序列越復(fù)雜，

29、復(fù)性就越慢。外在因 1.溫度：DNA/DNA雜交：適宜溫度為Tm - （ 20-25 C），與寡核昔酸探針朵交：適宜溫度為 Tm -5 Co 2.離子強(qiáng)度：低鹽濃度時(shí)雜交率較低，隨著鹽濃度增加，雜交率增加，高濃度的鹽使堿基 錯(cuò)配的朵交體更穩(wěn)定。（3）甲酰胺：甲酰胺能降低核酸的Tm值和雜交液的溫度，低溫時(shí)探針與待測(cè)核酸雜交更穩(wěn)定。4.非特異性朵交反應(yīng)：雜交前封閉非特異性雜交位點(diǎn)，減少其對(duì)探針的非特異性吸附。六、探針的種類和優(yōu)缺點(diǎn)1.基因組DNA探針：從基因組文庫(kù)里篩選得到一個(gè)特定的基因或基因片段的克隆后，大量擴(kuò)增、純化，切取插入片 段，分離純化為探針。真核基因組含有內(nèi)含子序列；因此，其用于檢測(cè)基

30、因表達(dá)時(shí)，雜交效率低。2. CDNA探針：通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，將其克隆于適當(dāng)?shù)目寺≥d體，通過(guò)擴(kuò)增重組質(zhì)粒而使cDNA得到大量的擴(kuò)增。提取質(zhì)粒后純化作為探針使用。是目前應(yīng)用最為廣泛的一種探針。3.RNA探針：采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針。4.寡核苗酸探針：根據(jù)己知的核酸順序，采用DNA合成儀合成一定長(zhǎng)度的寡核昔酸片段作為探針，極其方便。七、探針的標(biāo)記法1.全段標(biāo)記之缺口平移法：原理:用 DA酶I在DA雙鏈上隨機(jī)切開(kāi)若干切口，切口處形成3 -0H末端。大腸桿菌DNA聚合酶I從切口處開(kāi)始作用，以另一條DNA鏈為模板，以dNTPs為原料，在水解核昔酸的同時(shí)沿切口

31、進(jìn)行修復(fù)，標(biāo)記的核昔酸便隨之參入新鏈中，故稱：切口平行推移。利用大腸桿菌DYA聚合酶I同時(shí)具有的53核酸外切酶活性和53聚合酶活性，將預(yù)先用同位素或非同位素修飾的dNTP摻入到新合成的DNA探針中去。2.全段標(biāo)記之隨機(jī)引物法：隨即引物是人工合成的、含有各種可能排列順序的六核tF酸片段（46）的混合物。可以與任何核酸片段朵交，以此作為聚合酶反應(yīng)的弓I物。將這些引物與變性的DNA單鏈結(jié)合后，以4種dNTP （其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dTP為底物，合成與探針DNA互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的DNA探針。3.聚合酶鏈反應(yīng) WCR標(biāo)記DNA探針：在PCR反應(yīng)底物中，將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP,這樣標(biāo)記

32、的 dNTP就在PCR反DNA鏈上。4.RNA探針的標(biāo)記:RXA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄法制備，一邊合成一邊標(biāo)記。5.寡核苗酸鏈探針的標(biāo)記：可以通過(guò)在寡核苜酸合成時(shí)加入特定標(biāo)記的核苗酸來(lái)實(shí)現(xiàn)，也可以通過(guò)DNA探針的末端標(biāo)記法對(duì)其3或5末端進(jìn)行標(biāo)記。6.末端標(biāo)記法：只是將DNA片段的一端進(jìn)行標(biāo)記。八、PCR引物設(shè)計(jì)的基本要求1.序列應(yīng)位于高度保守區(qū)，與非擴(kuò)增區(qū)無(wú)同源序列，這樣可減少非特異結(jié)合。2.引物長(zhǎng)度以18-38nt為宜，多為20-24o 3. ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的卩票吟或咗噪核苛酸的成串排列，尤其 3端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或Co 4.G+C占50-60% :G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G

33、+C過(guò)多易岀現(xiàn)非特異條帶。5.兩引物間要有匹配的GC含量和相似的退火溫度。6.引物內(nèi)部避免有互補(bǔ)序列形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。7.引物3端為關(guān)鍵堿基，其第1, 2個(gè)堿基要嚴(yán)格配對(duì)，否則PCR失敗或擴(kuò)增效率和特異性降低。8.5 -端無(wú)嚴(yán)格限制，其堿基可不與模板DNA互補(bǔ)而呈游離狀態(tài)，因此可在其外設(shè)計(jì)附加序列（如引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，便于對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和克?。?，最多可加10個(gè)堿 基而對(duì)PCR反應(yīng)無(wú)影響。九、PCR的反應(yīng)條件10 X 擴(kuò)增緩沖液：10ul Mg2+: 1. 5mmol/L 4 種 dNTP 混合物：各 200umol/L引物：各 10 lOOpmol模板DA 0. 12ugTaq DNA聚合酶

34、：2. 5u加雙或三蒸水：總體積100ul十、Ct與模板DNA濃度的關(guān)系Ct與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)成反比：即起始模板DA量越多，熒光達(dá)到域值所需的循環(huán)數(shù)（ Ct ）越少Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系：通過(guò)己知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作岀標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算岀樣品中所含的模板量。十一、外標(biāo)法原理用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得待測(cè)樣品的Ct值即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算岀其起始拷貝數(shù)?！巴狻币粯?biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)品雖然在相同反應(yīng)條件下進(jìn)行，但是，它們不在同一反應(yīng)管！ 十二、探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量 PCR的特點(diǎn)1.特異性強(qiáng)：具有引物和探針的雙重特異性。2.重復(fù)性好：同一標(biāo)本的Ct值相同。3.敏感性