DNA提取原理和方法.ppt

,DNA提取方法簡介,DNA提取的幾種方法,基因組DNA的提取,CTAB法SDS法其它,DNA提取的幾種方法,非基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,堿裂解法煮沸法,線粒體、葉綠體DNA的提取,差速離心結(jié)合SDS裂解法,基因組DNACTAB法,CTAB法原理（植物DNA提取經(jīng)典方法）,CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨），是一種陽離子去污劑，可溶解細胞膜，并與核酸形成復合物。具有從低離子強度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在這種條件下，蛋白質(zhì)和中性多聚糖仍留在溶液里該復合物在高鹽溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，通過有機溶劑抽提，去除蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。,注：CTAB溶液在低于15時會形成沉淀析出，因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱，且離心時溫度不要低于15。,CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方,Tris-HCl（pH8.0）提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞；EDTA螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性；NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNP（脫氧核糖核蛋白）。CTAB溶解細胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離；-巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除,基因組DNACTAB法,CTAB提取緩沖液的改進配方,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。,基因組DNACTAB法,PVP（聚乙烯吡咯烷酮）,PVP按其平均分子量大小分為四級，習慣上常以K值表示，不同的K值分別代表相應(yīng)的PVP平均分子量范圍。K值實際上是與PVP水溶液的相對粘度有關(guān)的特征值，而粘度又是與高聚物分子量有關(guān)的物理量，因此可以用K值來表征PVP的平均分子量。通常K值越大，其粘度越大，粘接性越強。在研磨過程中加入PVP，其中的CO-N=基有很強的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類被氧化的機會。同時向抽提液中加入還原劑-巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。,CTAB法流程圖,植物材料,裂解液,上層溶液,液氮研磨,抽提,細胞裂解,干燥溶解,離心洗滌,酒精沉淀,DNA溶液,基因組DNACTAB法,SDS法原理,基因組DNASDS法,SDS是一種陰離子去垢劑，在高溫（5565）條件下能裂解細胞，使染色體離析，蛋白變性，釋放出核酸；提高鹽(KAc或NH4Ac)濃度并降低溫度（冰?。?，使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀，離心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反復抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取緩沖液,2.65水浴60min,其間緩慢搖動幾次。3.加入150ul的5mol/LKac,混勻,冰浴15min左右,SDS法流程圖（以動物組織為例）,基因組DNASDS法,基因組DNA其它方法,物理方式：玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法化學方式：異硫氰酸胍法、堿裂解法生物方式：酶法,根據(jù)細胞裂解方式的不同有：,基因組DNA其它方法,吸附材料結(jié)合法：,根據(jù)核酸分離純化方式的不同有：,硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠,高鹽低pH值結(jié)合核酸，低鹽高pH值洗脫?？旖莞咝?。,低鹽高pH值結(jié)合核酸，高鹽低pH值洗脫。適用于純度要求高的實驗。,磁性微粒掛上不同基團可吸附不同的目的物，從而達到分離目的。,基因組DNA其它方法,濃鹽法：有機溶劑抽提法：密度梯度離心法：,利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同，將二者分離,有機溶劑作為蛋白變性劑，同時抑制核酸酶的降解作用,利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物,質(zhì)粒DNA堿裂解法,堿裂解法原理,染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當用堿處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在回到中性pH時即恢復其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。,質(zhì)粒DNA堿裂解法,堿裂解法流程圖,對數(shù)期菌體,溶液III中和,溶液I充分重懸,溶液II裂解,上清液,抽提,離心洗滌,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,質(zhì)粒DNA溶液,SDS堿裂解法提取質(zhì)粒DNA中溶液1的成分及作用,溶液50mM葡萄糖/10mMEDTA/25mMTris-HCl，pH=8.0葡萄糖增稠，使懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；EDTA抑制DNase的活性。這一步溶液中還可以加入RNase，不受EDTA影響，并且可以在后續(xù)步驟中被除去溶液0.2MNaOH/1%SDS破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。溶液III3M醋酸鉀/2M醋酸這一步的K置換了SDS（十二烷基磺酸鈉）中的Na，得到PDS（十二烷基磺酸鉀）沉淀；SDS易與蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)也沉淀了，同時基因組DNA也被PDS共沉淀,質(zhì)粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色體DNA比質(zhì)粒DNA分子大得多，且染色體DNA為線狀分子，而質(zhì)粒DNA為共價閉合環(huán)狀分子；當加熱處理DNA溶液時，線狀染色體DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒DNA在冷卻時即恢復其天然構(gòu)象；變性染色體DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復性的超螺旋質(zhì)粒DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。,細胞器DNA差速離心法,差速離心法原理,是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法。將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。,線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細胞器，自身可編碼蛋白，它們的比重和大小一定，因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定，根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法，將細胞內(nèi)各種組分分級分離出來。,DNA提取的基本步驟,I.材料準備II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.核酸溶解在適量緩沖液或水中,材料準備,最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,使用處于對數(shù)期的新鮮菌體（老化菌體導致開環(huán)質(zhì)粒增加）培養(yǎng)時應(yīng)加入篩選壓力，否則菌體易污染，質(zhì)粒易丟失盡量選擇高拷貝的質(zhì)粒，如為低拷貝或大質(zhì)粒，則應(yīng)加大菌體用量菌株不要頻繁轉(zhuǎn)接（質(zhì)粒丟失）,嚴謹性質(zhì)粒和松弛性質(zhì)粒,按照復制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴緊型質(zhì)粒，當細胞染色體復制一次時，質(zhì)粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有12個質(zhì)粒；另一類是松弛型質(zhì)粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復制有時和它們的宿主細胞有關(guān)，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。,細胞裂解,材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶K細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時，定時輕柔振蕩,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,菌體量適當培養(yǎng)基去除干凈，同時保證菌體在懸浮液中充分懸浮變性的時間不要過長（5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷復性時間也不宜過長，否則會有基因組DNA的污染G菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機械法處理，以破壁,核酸分離、純化,采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間（獼猴桃大提，10000轉(zhuǎn)20min）針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,核酸分離、純化,蛋白質(zhì)的去除：酚/氯仿抽提使用變性劑變性（SDS、異硫氰酸胍等）高鹽洗滌蛋白酶處理,多糖的去除：高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入1/2體積的5MNaCl，高鹽可溶解多糖。用多糖水解酶將多糖降解。在提取緩沖液中加一定量的氯苯(1/2體積)，氯苯可以與多糖的羥基作用，從而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500LDNA液中加入200l20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。,核酸分離、純化,多酚的去除：在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑：-巰基乙醇、抗壞血酸、半胱氨酸、二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它們與酚類有較強的親和力，可防止酚類與DNA的結(jié)合,核酸分離、純化,鹽離子的去除：70的乙醇洗滌,核酸沉淀、溶解,當沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解,基因組DNA的提取,質(zhì)粒DNA的提取,DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子,重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)（具體方法見前）重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）,DNA提取常見問題,問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。,原因,對策,材料不新鮮或反復凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染反復凍融,盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融,DNA提取常見問題,問題二：DNA降解。,對策,原因,實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失,盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高溫裂解時，時間適當延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒,DNA提取常見問題,問題三：DNA提取量少。,對策,