03第三章 酶的提取與分離純化ppt課件

酶的提取與分離純化是指將酶從細(xì)胞或其他含酶原料中提取出來，再與雜質(zhì)分開，而獲得所要求的酶制品的過程。主要包括細(xì)胞破碎、提取、離心分離、過濾與膜分離、沉淀分離、層析分析、電泳分離、萃取分離、濃縮、干燥、結(jié)晶等,第四章酶的提取與分離純化,酶的提取、分離純化技術(shù)路線,第一節(jié)細(xì)胞破碎,細(xì)胞破碎是通過各種方法使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)破壞的技術(shù)過程,細(xì)胞結(jié)構(gòu),細(xì)胞破碎方法及其原理,（1）搗碎法利用搗碎機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)葉片所產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。如：動(dòng)物內(nèi)臟、植物葉芽、細(xì)菌的細(xì)胞破碎。（2）研磨法利用研缽、石磨、細(xì)菌磨、球磨等研磨器產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常用的方法?？梢约尤胄〔Ａ?、玻璃粉、石英砂或氧化鋁作助磨劑。常用于微生物和植物組織細(xì)胞破碎。（3）勻漿法利用勻漿器產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎的方法。通常用于破碎易于分散、比較柔軟、顆粒細(xì)小的組織細(xì)胞。,一、機(jī)械粉碎法,（1）溫度差破碎法利用溫度的突然變化、熱脹冷縮的作用使細(xì)胞破碎的方法。如將零下18冷凍的細(xì)胞突然放入高溫?zé)崴谢驅(qū)⑤^高溫度的熱細(xì)胞突然冷凍。常用于哪些較為脆弱、易于破碎的細(xì)胞（如G），注意操作溫度不能過高，以免引起酶的失活。（2）壓力差破碎法通過壓力的突然變化使細(xì)胞破碎的方法。常用的有高壓沖擊法、突然降壓法和滲透壓變化法。高壓沖擊法在結(jié)實(shí)的圓柱體容器內(nèi)裝上菌體與助磨劑，用活塞或沖擊錘加壓沖擊，以破碎細(xì)胞；爆破性減壓法將菌體懸浮在N2/CO2高壓下平衡，37振蕩數(shù)分鐘，然后突然減壓，使細(xì)胞壁、膜破碎。,二、物理破碎法,滲透壓變化法是利用滲透壓的變化使細(xì)胞破碎。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸浮在高滲透壓溶液中（20%蔗糖溶液）平衡一段時(shí)間，然后離心收集細(xì)胞，將其迅速投入4左右的蒸餾水或其他低滲溶液中，由于細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓差別而使細(xì)胞破碎。適合膜結(jié)合蛋白、細(xì)胞間質(zhì)酶等的提取，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌不適用（肽多糖）（3）超聲波破碎法利用超聲波發(fā)生器所產(chǎn)生的聲波或超聲波的作用，通過液體時(shí)形成局部減壓，叫空化作用，旋渦生成與消失時(shí)，產(chǎn)生很大壓力，從而使細(xì)胞破碎。超聲波破碎具有簡(jiǎn)便、快捷、效果好等特點(diǎn)，特別適合微生物細(xì)胞的破碎。,三、化學(xué)破碎法,通過各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎的方法。常用有機(jī)試劑有甲苯、丙酮、丁醇和氯仿等，表面活性劑：特里頓和吐溫。有機(jī)溶劑可以使細(xì)胞膜的磷脂結(jié)構(gòu)破壞，從而改變細(xì)胞膜的通透性，但應(yīng)當(dāng)在低溫下操作以防酶變性失活。表面活性劑可以和細(xì)胞膜的磷脂以及脂蛋白相互作用，使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)破壞，改變細(xì)胞膜通過性。,四、酶促破碎法,通過細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎的方法。自溶法：將細(xì)胞在一定的pH和溫度條件下保溫一段時(shí)間，利用細(xì)胞本身酶系的作用，使細(xì)胞破壞而使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來的方法。溶菌酶處理用溶菌酶專一性地分解菌體細(xì)胞壁上肽多糖分子的-1，4-糖苷鍵，從而破壞細(xì)胞壁。酵母細(xì)胞：-葡聚糖酶霉菌：幾丁質(zhì)酶,超聲波細(xì)胞粉碎機(jī),電動(dòng)玻璃勻漿機(jī),高壓細(xì)胞粉碎機(jī),細(xì)胞破碎珠,第二節(jié)酶的提取,酶的提取是指在一定的條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈?，使酶充分溶解到溶劑或溶液中的過程。也稱為酶的抽提。酶提取時(shí)首先應(yīng)根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和溶解性質(zhì)，選擇適當(dāng)?shù)娜軇?。一般說來，極性物質(zhì)易溶于極性溶劑中，非極性物質(zhì)易溶于非極性的有機(jī)溶劑中，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑中，堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑中。酶都能溶解于水，通?？捎盟蛳∷?、稀堿、稀鹽溶液等進(jìn)行提取，有些酶與脂質(zhì)結(jié)合或含有較多的非極性基團(tuán)，則可用有機(jī)溶劑提取。,一酶的主要提取方法,1、溫度溫度通?？刂圃?4左右。如果酶比較穩(wěn)定時(shí)，可以例外。如胃蛋白酶可在37保溫抽提。2、pH選用pH，首先考慮酶的穩(wěn)定性。選用pH不應(yīng)超過酶的pH穩(wěn)定范圍。其次，從抽提效果出發(fā)，最好遠(yuǎn)離待抽提酶的等電點(diǎn)。也就是說，酸性蛋白宜用堿性溶液抽提；堿性蛋白宜用酸性溶液抽提。3、抽提液用量抽提液用量常采用原料量的35倍。有時(shí)，為了抽提效果好些需要反復(fù)抽提時(shí)，抽提溶液比例可能大些。,二、影響提取的主要因素,第三節(jié)沉淀分離,沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。,鹽溶：球蛋白在低濃度鹽溶液中，其溶解度隨鹽離子強(qiáng)度升高而加大的現(xiàn)象。這主要是由于蛋白質(zhì)分子吸附某種鹽離子后，帶電表層使蛋白質(zhì)分子彼此排斥，而與水之間相互作用加強(qiáng)，因而溶解度提高。鹽析：當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高到一定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度隨鹽濃度的升高而降低，結(jié)果使蛋白沉淀析出，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用的理論基礎(chǔ)尚不明了，大致是由于高鹽離子使水的相對(duì)濃度降低，蛋白質(zhì)失去水化作用，引起分子之間疏水部分吸引力增加，以致沉淀析出。,一、鹽析沉淀法,式中：S為酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I時(shí)的溶解度（g/L）；S0為酶或蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為0時(shí)的溶解度（g/L）；Ks為鹽析系數(shù)；I為離子強(qiáng)度。溫度和pH一定時(shí)，S0為一常數(shù)。,在一定的溫度和pH值條件下（為常數(shù)），通過改變離子強(qiáng)度使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法稱為Ks分段鹽析；而在一定的鹽和離子強(qiáng)度的條件下（KsI為常數(shù)），通過改變溫度和pH值，使不同的酶或蛋白質(zhì)分離的方法，稱為分段鹽析。,在蛋白質(zhì)的鹽析中，通常采用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、鉀、鎂、氯化鈉和磷酸鈉等。其中以硫酸銨最為常用。這是由于硫酸銨在水中的溶解度大而且溫度系數(shù)小，不影響酶的活性，分離效果好，而且價(jià)廉易得。,各種酶所需硫酸銨的沉淀濃度是不同的，所以可用分級(jí)沉淀法將各種酶分級(jí)沉淀。硫酸銨鹽析時(shí)溶液的鹽濃度以飽和度表示，飽和鹽溶液的飽和度為100(在0約為4mol)，調(diào)整鹽濃度有兩種方法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大，要達(dá)到的鹽濃度不高，可加入飽和硫酸銨溶液，100m1硫酸銨溶液，由飽和度S1變?yōu)镾2，應(yīng)向其中加入的飽和硫酸銨溶液的ml數(shù)(V)為：VVo(S2S1)/(1S2),當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)原有體積較大，要達(dá)到的鹽濃度又較高，此時(shí)加入固體硫酸銨為宜。在0、25下，硫酸銨濃度由飽和度Sl增至S2。應(yīng)向1L溶液中添加的固體硫酸銨的克數(shù)，可以直接查表,鹽析的優(yōu)點(diǎn)：不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，經(jīng)透析去鹽后，能得到保持生物活性的純化蛋白質(zhì)。,注意事項(xiàng)：鹽析的成敗決定于溶液的pH值與離子強(qiáng)度，溶液pH值越接近蛋白的等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)越容易沉淀。鹽析一般用的硫酸銨，容易吸潮，因而在使用前，一般先磨碎，平鋪放入烤箱內(nèi)60攝氏度烘干后再稱量，這樣更準(zhǔn)確。在加入鹽時(shí)應(yīng)該緩慢均勻，攪拌也要緩慢，越到后來速度應(yīng)該更注意緩慢，如果出現(xiàn)一些未溶解的鹽，應(yīng)該等其完全溶解后再加鹽，以免引起局部的鹽濃度過高，導(dǎo)致酶失活。鹽析后最好攪拌40分鐘到一個(gè)小時(shí)而且再在冰浴中放置一段時(shí)間。鹽析后的蛋白質(zhì)最好盡快脫鹽處理，以免變性，透析較慢，一般可用超濾或者G-25，G-50處理。,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，所帶電荷則因pH變化而變化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于等電點(diǎn)（pI）pH時(shí)，蛋白質(zhì)的靜電荷為零，相同蛋白質(zhì)分子間沒有了靜電排斥作用而趨于聚結(jié)沉淀，溶解度達(dá)到最低點(diǎn)。不同蛋白質(zhì)具有不同的pI值，利用蛋白質(zhì)在pI時(shí)溶解度最低的原理，可以把不同的蛋白質(zhì)分開。,二、等電點(diǎn)沉淀法,在酶溶液中加入與水互溶的有機(jī)溶劑，可降低溶液的介電常數(shù)使酶分子間的靜電引力增強(qiáng)而發(fā)生沉淀。另外，有機(jī)溶劑也可能使酶蛋白脫水而發(fā)生沉淀。,三、有機(jī)溶劑沉淀法,常用于酶的沉淀分離的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、甲醇等,有機(jī)溶劑的濃度以百分體積(m1)比表示。加入量依下式計(jì)算V=Vo(S2S1)/(SS2)式中：V為應(yīng)加入的有機(jī)溶劑體積；Vo為原有的體積；S、S1、S2分別為待加的、原溶液中含有的及所達(dá)到的有機(jī)溶劑百分比濃度。,世界酶學(xué)史上第一個(gè)酶蛋白結(jié)晶便是Sumner在刀豆脲酶抽提液中加入32丙酮得到的脲酶結(jié)品。,溫度因?yàn)榇蠖鄶?shù)球蛋白在有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定，特別是在溫度較高時(shí)，更易變性失活。因此，所有操作必須在0以下進(jìn)行，有機(jī)溶劑必須冷卻至-15-20，然后攪拌下緩慢加入，沉淀析出后趕快離心分離，并用預(yù)冷緩沖液溶解所得沉淀，以降低有機(jī)溶劑濃度。,pH一般在進(jìn)行有機(jī)溶劑法時(shí)，溶液pH盡可能靠近待純化酶的pI值。此法分辨率較高、溶劑易除去，但易引起酶的變性失活。,影響有機(jī)溶劑沉淀法的因素：,大分子量的非離子型聚合物，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯亞胺(PEI)、單寧酸、硫酸鏈霉素以及離子型表面活性劑(SDS等)，用來沉淀蛋白質(zhì)的方法。它們?cè)谝欢l件下能與蛋白質(zhì)直接或間接形成絡(luò)合物，使蛋白質(zhì)析出，離心后收集沉淀。再用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ姑溉芙獬鰜?。如：PEG常用到的分子量為6000和4000的20(W/V)的濃度能將許多蛋白質(zhì)沉淀出來。,四、復(fù)合沉淀法,五、選擇性變性沉淀法,選擇一定的條件使酶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀，而不影響所需的酶的分離方法。如對(duì)于熱穩(wěn)定性好的酶如-淀粉酶，可以通過加熱處理，使大多數(shù)雜蛋白變形沉淀而被除去。,第四節(jié)離心分離,一、離心原理,離心分離是借助于離心機(jī)旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。根據(jù)物質(zhì)顆粒的沉降系數(shù)、質(zhì)量、密度及浮力等特點(diǎn)進(jìn)行分離。當(dāng)含有細(xì)小顆粒的懸浮液靜置不動(dòng)時(shí)，由于重力場(chǎng)的作用使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會(huì)上浮。微粒在重力場(chǎng)下移動(dòng)的速度與微粒的大小、形態(tài)和密度有關(guān)，并且又與重力場(chǎng)的強(qiáng)度及液體的粘度有關(guān)。,在離心分離時(shí)，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機(jī)、離心方法和離心條件。,1、離心力質(zhì)量為m的粒子以一定的角速度作圓周運(yùn)動(dòng)時(shí)受到向外的離心力。顆粒沉降速度決定于應(yīng)用的離心加速度（ac），它決定于轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒）與半徑（厘米）。,（1）,由于轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)一圈等于2弧度，角速度則為：,（2）,式中n為轉(zhuǎn)子每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，為轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒）。以（2）帶入（1）中，離心加速度即為：,（3）,由此可知離心力大小與轉(zhuǎn)速的平方成正比，與半徑成正比。在實(shí)際工作中半徑是以平均迴轉(zhuǎn)半徑計(jì)算，即由軸心到離心溶液中心的迴轉(zhuǎn)半徑計(jì)算。通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對(duì)離心力（RCF）表示，如：65000g。,離心力一般用相對(duì)離心力RCF，即離心力的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用RCFg表示，g為重力加速度（980厘米/秒2）。,2、沉降速度和沉降系數(shù),沉降系數(shù)指單位離心力下顆粒的沉降速度，用S表示。用離心法時(shí)，大分子沉降速度的量度，等于每單位離心場(chǎng)的速度?；騭=v/2r。s是沉降系數(shù)，是離心轉(zhuǎn)子的角速度（弧度/秒），r是到旋轉(zhuǎn)中心的距離，v是沉降速度。沉降系數(shù)以每單位重力的沉降時(shí)間表示。由于許多生物大分子的S值很小，所以定義10-13s為一個(gè)沉降單位，1S=110-13s。常用S表示某些生物大分子、亞細(xì)胞及亞細(xì)胞器的大小，如16sRNA，蛋白質(zhì)的沉降系數(shù)一般在1200之間。,沉降速度是指在離心力作用下，單位時(shí)間內(nèi)物質(zhì)運(yùn)動(dòng)的距離。,常速離心機(jī)又稱為低速離心機(jī),其最大轉(zhuǎn)速在8000r/min以內(nèi)，相對(duì)離心力（RCF）在1104g以下，在酶的分離純化過程中，主要用于細(xì)胞、細(xì)胞碎片和培養(yǎng)基殘?jiān)裙绦挝锏姆蛛x。也用于酶的結(jié)晶等較大顆粒的分離。,高速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速為（12.5）104r/min，相對(duì)離心力達(dá)到11041105g，在酶的分離中主要用于沉淀、細(xì)胞碎片和細(xì)胞器等的分離。為了防止高速離心過程中,溫度升高而造成酶的變性失活，有些高速離心機(jī)裝設(shè)有冷凍裝置，謂之高速冷凍離心機(jī)。,超速離心機(jī)的最大轉(zhuǎn)速達(dá)(2.512)104r/min，相對(duì)離心力可以高達(dá)5105g甚至更高。超速離心主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度的檢測(cè)；沉降系數(shù)和相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定等。,二、離心機(jī)的選擇,低速離心機(jī),高冷凍速離心機(jī),大容量離心機(jī),三、離心方法的選用,1、差速離心是采用不同的離心速度和離心時(shí)間，使不同沉降速度的顆粒分批分離的方法。在選擇離心轉(zhuǎn)速時(shí)，應(yīng)先采用低速離心，使最大顆粒沉于管底。去掉沉淀后，再增加離心力，分離出中等大小的顆粒。最后按照最小顆粒選擇離心力，使其形成沉淀。對(duì)形成的各級(jí)沉淀經(jīng)過重懸浮、再離心的過程來進(jìn)一步純化。,特點(diǎn)：用于分離大小和密度差異較大的顆粒。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單。缺點(diǎn)：分離效果較差，不能一次得到純顆粒。,2、密度梯度離心是樣品在密度梯度介質(zhì)中進(jìn)行離心，使沉降系數(shù)比較接近的物質(zhì)得以分離的一種區(qū)帶分離方法。常用的梯度介質(zhì)有蔗糖和甘油。,3、等密梯度離心當(dāng)欲分離的不同顆粒的密度范圍處于離心介質(zhì)的密度范圍內(nèi)時(shí)，在離心力的作用下，不同浮力密度的顆?；蛳蛳鲁两?，或向上漂浮，只要時(shí)間足夠長(zhǎng)，就可以一直移動(dòng)到與他們各自浮力密度恰好相等的位置。常用的離心介質(zhì)是銫鹽如氯化銫（CsCl）。,特點(diǎn)：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度；適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。,特點(diǎn)：a.介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。b.適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。,總結(jié)：1)等密度梯度離心是一種測(cè)定顆粒浮力密度的靜力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇氯化銫濃度，使之包括待分離物的密度范圍。2)差速離心是一種動(dòng)力學(xué)方法，關(guān)鍵在于選擇適合于各分離物的離心力。3）密度梯度離心兼有以上兩種方法的特點(diǎn)，關(guān)鍵在于制備優(yōu)質(zhì)的密度梯度溶液。,三、離心條件的確定,1、離心時(shí)間離心時(shí)間的概念依據(jù)離心方法的不同有所差別。常速離心、高速離心和差速離心：離心時(shí)間是指顆粒顆粒從離心管中樣品液的液面完全沉降到離心管底的時(shí)間，稱為沉降時(shí)間或澄清時(shí)間。密度梯度離心：離心時(shí)間是指形成界限分明的區(qū)帶的時(shí)間，稱為區(qū)帶形成時(shí)間。等密度離心：離心時(shí)間是指顆粒完全達(dá)到等密度點(diǎn)的平衡時(shí)間，稱為平衡時(shí)間。,2、溫度和pH離心溫度控制在4。,第五節(jié)過濾與膜分離,過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。,過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。,過濾介質(zhì)不同,非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì),膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì),過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同),一、非膜過濾,1粗濾常壓過濾：以液位差為推動(dòng)力的過濾方法加壓過濾：以壓力泵或壓縮空氣為推動(dòng)力的過濾方法減壓過濾：又稱為真空過濾或抽濾，是通過在過濾介質(zhì)的下方抽真空，以增加過濾介質(zhì)上下方之間的壓力差，推動(dòng)液體通過過濾介質(zhì)，而把大顆粒截留的過濾方法。2微濾微孔過濾：微濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒直徑為0.22m，主要用于細(xì)菌、灰塵等，物質(zhì)顆粒的過濾。常用于無菌水、礦泉水、汽水的生產(chǎn)。,采用高分子膜以外的材料，如濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和燒結(jié)金屬等作為過濾介質(zhì)的分離技術(shù)。包括粗濾和部分微濾。,借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時(shí)也可以采用動(dòng)物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時(shí)選擇。,膜分離,加壓膜分離,微濾超濾反滲透,電場(chǎng)膜分離,電滲析離子交換膜電滲析,擴(kuò)散膜分離,透析,二、膜分離技術(shù),1、加壓膜分離,1）微濾：以微濾膜作為過濾介質(zhì)的膜分離技術(shù)。如空氣過濾。,2）反滲透,反滲透膜的孔徑小于20，截留物質(zhì)分子量小于1000Da。主要用于分離各種離子和小分子物質(zhì)，用于無離子水制備、海水淡化等。,反滲透裝備,超過濾是在加壓的條件下，將酶溶液通過一層只允許小分子物質(zhì)選擇透過微孔半透膜而酶等大分子物質(zhì)被截留，從而達(dá)到濃縮的目的。如果采用不同孔徑的膜，同時(shí)又具有分級(jí)分離的作用。優(yōu)點(diǎn)：不需加熱，更適用于熱敏物濃縮；無相變化、設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便；能在廣泛的pH條件下操作等。,3）超濾,超濾膜一般有兩層組成，表層和基層，表層要面向待超濾的物料溶液。,中空纖維超濾,超濾膜主要類型：平面膜將膜平鋪在多孔支持板上，加壓下(可帶有攪拌)酶溶液從膜面流過水及小分子溶質(zhì)透過膜孔而排比，大分子(如酶)被截留.管式膜將管式膜置于多孔硬管的外側(cè)或內(nèi)側(cè)，酶溶液在管內(nèi)或管外流動(dòng)，水和分子溶質(zhì)透過越濾膜，而大分子物質(zhì)被截留而濃縮。中空纖維將聚砜作成中空纖維膜，成束中空纖維裝在圓筒真空超濾器中。,超濾設(shè)備,2電場(chǎng)膜分離,1）電滲析,2）離子交換膜電滲析,在半透膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。在電場(chǎng)的作用下，小分子的帶電物質(zhì)或離子向著與其本身所帶電荷相反的電極移動(dòng)，透過半透膜，達(dá)到分離的目的。主要用于酶溶液脫鹽。,用離子交換膜代替一般的半透膜。離子交換膜帶有某種基團(tuán)，只讓戴一種電荷的顆粒通過。選擇透過性強(qiáng)。應(yīng)用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。,3擴(kuò)散膜分離,透析膜的使用,透析(Dialysis)是利用蛋白質(zhì)不能通過半透膜,使蛋白質(zhì)和其他小分子物質(zhì)如無機(jī)鹽、單糖、水等分開,將待提純的溶液裝入半透膜的透析袋中，放入蒸餾水或緩沖液中，小分子物質(zhì)借擴(kuò)散進(jìn)入透析袋外的蒸餾水或緩沖液中。這樣通過更換透析袋外液，使透析袋內(nèi)的小分子物質(zhì)降至最低。如右圖。,第六節(jié)層析分離,層析技術(shù)，亦稱色譜技術(shù)，是一種物理的分離方法。它是利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)（分子的大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等）的差別，使各組分以不同程度分布在兩個(gè)相中，其中一個(gè)相為固定的(稱為固定相)，另一個(gè)相則流過此固定相(稱為流動(dòng)相)并使各組分以不同速度移動(dòng)，從而達(dá)到分離。,層析分離方法,吸附層析是利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)的吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附層析是各種層析技術(shù)中應(yīng)用最早的技術(shù)。,一、吸附層析,1吸附層析原理,吸附：任何兩個(gè)相之間都可以形成一個(gè)界面，其中一個(gè)相中的物質(zhì)在兩相界面上密集的現(xiàn)象。吸附劑：凡是能夠?qū)⑵渌镔|(zhì)聚集到自己表面上的物質(zhì)。一般是固體或液體，常用的是固體吸附劑。能聚集于吸附劑表面的物質(zhì)稱為被吸附物。吸附劑與被吸附物之間的相互作用力主要是范德華力，其特點(diǎn)是可逆的。,吸附層析通常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時(shí)，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進(jìn)入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。利用固定相的固體吸附劑表面對(duì)不同組分吸附力的大小及洗脫液對(duì)它的溶解作用（解吸作用）的差異進(jìn)行分離。在洗脫時(shí)，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。,固體表面的吸附理論以郎格茂的吸附理論較為著名。他認(rèn)為，在固體內(nèi)部各個(gè)原子(或原子團(tuán))的吸引力可以平均地分配到周圍原子或原子團(tuán)上去，從而使吸引力場(chǎng)成為飽和平衡的狀態(tài)。但在表面的各個(gè)原子或原子團(tuán)的吸引力不能得到飽和，還有一面伸向空間，能夠吸附住空間中與它鄰近的其他分子這種化合價(jià)力的剩余力量就是吸附劑吸附力的本質(zhì)。,2洗脫方法：溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法,溶劑洗脫法,是采用單一或者混合的溶劑進(jìn)行洗脫的方法，是目前應(yīng)用最廣泛的方法。,置換洗脫法,前緣洗脫法,所用的洗脫液是置換洗脫液。置換洗脫液中含有一種吸附力比被吸附組分更強(qiáng)的物質(zhì)，稱為置換劑。當(dāng)用置換洗脫劑沖洗層析柱時(shí)，置換劑取代了原來被吸附組分的位置，使被吸附組分不斷下向移動(dòng)，經(jīng)過一段時(shí)間之后，樣品中的各組分按吸附力從強(qiáng)到弱的順序先后流出，最后流出的是置換劑本身。,是連續(xù)向吸附層析柱內(nèi)加入欲分離的混合溶液，即所用的洗脫液為含有各組分的混合液本身。,常用來吸附酶的吸附劑有硅藻土、活性氧化鋁、磷酸鈣膠、羥基磷灰石、活性炭等。常用的洗脫劑有：石油醚、環(huán)己烷、四氯化碳、甲苯、乙醚、氯仿、丙酮、乙醇、甲醇等,吸附劑來源豐富、價(jià)格低廉、可再生，吸附設(shè)備簡(jiǎn)單。,3吸附劑,二分配層析,分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。,分配系數(shù)是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達(dá)到平衡時(shí)，該溶質(zhì)在兩項(xiàng)溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。,在分配層析中，通常采用一種多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動(dòng)，稱為流動(dòng)相。溶質(zhì)在兩相之間進(jìn)行連續(xù)的動(dòng)態(tài)分配。,1、紙上層析,以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質(zhì)，能形成水相和展層溶劑的兩相系統(tǒng)，被分離物質(zhì)在兩相中的分配保持平衡關(guān)系。紙層析用于分析簡(jiǎn)單的混合物時(shí)可做單向?qū)游觥?2、薄層層析,是將吸附劑、載體或其他活性物質(zhì)（如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚酰胺等）均勻涂鋪在平面板（如玻璃板、塑料片、金屬片等）上，形成薄層（常用厚度為0.25毫米左右）后，在此薄層上進(jìn)行層析分離的分析方法。薄層層析較紙層析優(yōu)越在于分辨高，展層時(shí)間短。,是利用離子交換劑上的可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）對(duì)各種離子的親和力不同而達(dá)到分離目的的一種層析分離方法。,三、離子交換層析,離子交換劑是含有若干活性基團(tuán)的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團(tuán)（活性基團(tuán)）而制成。作為不溶性母體的不溶性物質(zhì)通常有苯乙烯樹脂、酚醛樹脂、纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等。按活性基團(tuán)的性質(zhì)不同，離子交換劑可以分為陽(yáng)離子交換劑和陰離子交換劑。酶分子具有兩性性質(zhì)，所以可用陽(yáng)離子交換劑，也可用陰離子交換劑進(jìn)行酶的分離純化。,1、離子交換劑的選擇與處理,1）離子交換劑的類型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子樹脂這類樹脂含有大量的強(qiáng)酸性基團(tuán)，如磺酸基SO3H，容易在溶液中離解出H+，故呈強(qiáng)酸性。樹脂離解后，本體所含的負(fù)電基團(tuán)，如SO3，能吸附結(jié)合溶液中的其他陽(yáng)離子。這兩個(gè)反應(yīng)使樹脂中的H+與溶液中的陽(yáng)離子互相交換。弱酸性陽(yáng)離子樹脂這類樹脂含弱酸性基團(tuán)，如羧基COOH，能在水中離解出H+而呈酸性。樹脂離解后余下的負(fù)電基團(tuán)，如R-COO(R為碳?xì)浠鶊F(tuán))，能與溶液中的其他陽(yáng)離子吸附結(jié)合，從而產(chǎn)生陽(yáng)離子交換作用。這種樹脂的酸性即離解性較弱，在低pH下難以離解和進(jìn)行離子交換，只能在堿性、中性或微酸性溶液中(如pH514)起作用。,強(qiáng)堿性陰離子樹脂這類樹脂含有強(qiáng)堿性基團(tuán)，如季胺基(亦稱四級(jí)胺基)NR3OH(R為碳?xì)浠鶊F(tuán)，CH3)，能在水中離解出OH而呈強(qiáng)堿性。這種樹脂的正電基團(tuán)能與溶液中的陰離子吸附結(jié)合，從而產(chǎn)生陰離子交換作用。弱堿性陰離子樹脂含有弱堿性基團(tuán)，如伯胺基(亦稱一級(jí)胺基)-NH2、仲胺基(二級(jí)胺基)-NHCH3、或叔胺基(三級(jí)胺基)-N(CH3)2，它們?cè)谒心茈x解出OH而呈弱堿性。這種樹脂的正電基團(tuán)能與溶液中的陰離子吸附結(jié)合，從而產(chǎn)生陰離子交換作用。,離子交換纖維素,在交換纖維素中，最常用的是DEAE纖維素和CM纖維素。,離子交換交聯(lián)葡聚糖,2)離子交換劑的選擇a.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇：強(qiáng)型：適用的pH范圍廣，制備無離子水弱型：適用的pH范圍窄，分離生物大分子物質(zhì)b.陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇：酶的穩(wěn)定性若pI穩(wěn)定，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，用陰離子交換劑,3)離子交換劑的處理,陽(yáng)離子交換樹脂的預(yù)處理步驟首先用清水對(duì)樹脂進(jìn)行沖洗（最好為反洗）洗至出水清澈無混濁、無雜質(zhì)為止。而后用45%的HCl和NaOH在交換柱中依次交替浸泡24小時(shí)，在酸堿之間用大量清水淋洗（最好用混合床高純度去離子水進(jìn)行淋洗）至出水接近中性，如此重復(fù)23次，每次酸堿用量為樹脂體積的2倍。最后一次處理應(yīng)用45%的HCl溶液進(jìn)行，用量加倍效果更好。放盡酸液，用清水淋洗至中性即可待用。陰離子交換樹脂的預(yù)處理步驟首先用清水對(duì)樹脂進(jìn)行沖洗（最好為反洗），洗至出水清澈無混濁、無雜質(zhì)為止。而后用45%的NaOH和HCl在交換柱中依次交替浸泡24小時(shí)，在堿酸之間用大量清水淋洗（最好用混合床高純度去離子水進(jìn)行淋洗）至出水接近中性，如此重復(fù)23次，每次酸堿用量為樹脂體積的2倍。最后一次處理應(yīng)用45%的NaOH溶液進(jìn)行，用量加倍效果更好。放盡堿液，用清水淋洗至中性即可待用。,2離子交換層析的基本操作,1）層析柱和裝柱離子交換層析要根據(jù)分離的樣品量選擇合適的層析柱，離子交換用的層析柱一般粗而短，不宜過長(zhǎng)。直徑和柱長(zhǎng)比一般為1:10到1:50之間，層析柱安裝要垂直。裝柱時(shí)要均勻平整，不能有氣泡。裝柱方法有干法和濕法裝柱兩種,2）平衡緩沖液,3）上樣,平衡緩沖液的離子強(qiáng)度和pH的選擇首先要保證各個(gè)待分離物質(zhì)如蛋白質(zhì)的穩(wěn)定。其次是使待分離樣品與離子交換劑有較穩(wěn)定的結(jié)合。而盡量使雜質(zhì)不與離子交換劑結(jié)合或結(jié)合不穩(wěn)定。,上樣量也不宜過大，一般為柱床體積的15為宜，以使樣品能吸附在層析柱的上層，得到較好的分離效果。樹脂交換容量。,4）洗脫緩沖液：,常用梯度洗脫，通常有改變離子強(qiáng)度和改變pH兩種方式。改變離子強(qiáng)度通常是在洗脫過程中逐步增大離子強(qiáng)度，從而使與離子交換劑結(jié)合的各個(gè)組分被洗脫下來；而改變pH的洗脫，對(duì)于陽(yáng)離子交換劑一般是pH從低到高洗脫，陰離子交換劑一般是pH從高到低。由于pH可能對(duì)蛋白的穩(wěn)定性有較大的影響，故一般通常采用改變離子強(qiáng)度的梯度洗脫。,有線性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分級(jí)梯度等洗脫方式。一般線性梯度洗脫分離效果較好，故通常采用線性梯度進(jìn)行洗脫。,5）洗脫速度,洗脫液的流速也會(huì)影響離子交換層析分離效果，洗脫速度通常要保持恒定。一般來說洗脫速度慢比快的分辨率要好，但洗脫速度過慢會(huì)造成分離時(shí)間長(zhǎng)、樣品擴(kuò)散、譜峰變寬、分辨率降低等副作用，所以要根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的洗脫速度。如果洗脫峰相對(duì)集中某個(gè)區(qū)域造成重疊，則應(yīng)適當(dāng)降低洗脫速度來提高分辨率；如果分辨率較好，但洗脫峰過寬，則可適當(dāng)提高洗脫速度。,6）再生,酸堿交替浸泡處理和轉(zhuǎn)型,又稱為凝膠過濾，分子排阻層析，分子篩層析等。是指以各種多孔凝膠為固定相，利用流動(dòng)相中所含各種組分的相對(duì)分子質(zhì)量不同而達(dá)到物質(zhì)分離的一種層析技術(shù)。,四凝膠層析,凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進(jìn)入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進(jìn)入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進(jìn)出于一個(gè)個(gè)顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動(dòng)的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對(duì)分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達(dá)到分離的目的。,1、凝膠層析的基本原理,凝膠層析的基本概念,外水體積（V0）：指凝膠柱中凝膠顆粒周圍空間的體積，也就是凝膠顆粒間液體流動(dòng)相的體積。內(nèi)水體積（Vi）:是指凝膠顆粒中孔穴的體積。洗脫體積（Ve）：是指將樣品中某一組分洗脫下來所需洗脫液的體積。,分配系數(shù)分配系數(shù)是指某個(gè)組分在固定相和流動(dòng)相中的濃度比。對(duì)于凝膠層析，分配系數(shù)實(shí)質(zhì)上表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。在凝膠層析中，分配系數(shù)通常表示為：Ka=(Ve-V0)/(Vi),當(dāng)Ka=0，即VeVo，說明該組分不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，而只存在于流動(dòng)相中（完全排阻的大分子），洗脫時(shí)最先流出當(dāng)Ka=1，即VeVo+Vi，對(duì)于，由于它可以自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入到凝膠顆粒內(nèi)部所有微孔（完全滲透的小分子），洗脫時(shí)最后流出。分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。,排阻極限排阻極限是指不能進(jìn)入凝膠顆粒孔穴內(nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時(shí)被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到分離。例如SephadexG-50的排阻極限為30000，它表示分子量大于30000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。,2、凝膠的選擇和處理,葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是指由天然高分子葡聚糖與交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠。常見的有兩大類，商品名分別為Sephadex和Sephacryl。葡聚糖凝膠中最常見的是Sephadex系列。Sephadex的主要型號(hào)是G-10G-200，后面的數(shù)字是凝膠的吸水率（單位是ml/g干膠）乘以10。如SephadexG-50，表示吸水率是5ml/g干膠。數(shù)字越大的，排阻極限越大，分離范圍也越大。,聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠是丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)而成。改變丙烯酰胺的濃度，就可以得到不同交聯(lián)度的產(chǎn)物。聚丙烯酰胺凝膠商品名為Bio-GelP，主要型號(hào)有Bio-GelP-2Bio-GelP-300等10種，后面的數(shù)字基本代表它們的排阻極限的10-3，所以數(shù)字越大，可分離的分子量也就越大。排阻極限最大的Bio-GelP-300為4105,瓊脂糖與瓊脂糖凝膠瓊脂糖是從瓊脂中分離出來的天然線性多糖，它是瓊脂去掉其中帶電荷的瓊脂膠得到的。瓊脂糖在100C時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度降至45C以下時(shí)，多糖鏈以氫鍵方式相互連接形成雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即成為束狀的瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠的排阻極限很大，分離范圍很廣，適合于分離大分子物質(zhì)，但分辨率較低。,凝膠的選擇首先要根據(jù)分離組分的分子量大小確定一個(gè)合適的分離范圍。另外一個(gè)方面就是凝膠顆粒的大小。顆粒小，分辨率高，但相對(duì)流速慢，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)，有時(shí)會(huì)造成擴(kuò)散現(xiàn)象嚴(yán)重；顆粒大，流速快，分辨率較低但條件得當(dāng)也可以得到滿意的結(jié)果。,3、凝膠層析的基本操作,（1）層析柱的選擇層析柱的長(zhǎng)度對(duì)分辨率影響較大，長(zhǎng)的層析柱分辨率要比短的高；但層析柱長(zhǎng)度不能過長(zhǎng)，否則會(huì)引起柱子不均一、流速過慢等實(shí)驗(yàn)上的一些困難。一般柱長(zhǎng)度不超過100cm，為得到高分辨率，可以將柱子串聯(lián)使用。層析柱的直徑和長(zhǎng)度比一般在1:251:100之間。脫鹽柱由于對(duì)分辨率要求較低，所以一般比較短。,（2）凝膠柱的鑒定凝膠柱填裝后用肉眼觀察應(yīng)均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以采用一種有色的物質(zhì)，如藍(lán)色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區(qū)帶在柱中的洗脫行為以檢測(cè)凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。,（3）洗脫液的選擇由于凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴于溶劑強(qiáng)度和選擇性的改變來進(jìn)行分離，所以凝膠層析洗脫液的選擇不那么嚴(yán)格。洗脫液的選擇主