病毒包裝與感染ppt課件VIP

.,病毒包裝與感染,.,基因載體系統(tǒng),病毒載體系統(tǒng),非病毒載體系統(tǒng),腺病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,腺相關(guān)病毒載體,單純皰疹病毒載體,慢病毒載體,裸DNA,DNA-陽離子脂質(zhì)復(fù)合物,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,細(xì)胞內(nèi)包裝,細(xì)胞外包裝,DNA-陽離子多聚物,DNA/RNA嵌合物,.,基本概念：即病毒載體介導(dǎo)基因技術(shù)，一種高效的基因轉(zhuǎn)移工具，將外源基因包裝到天然病毒的外殼中，利用病毒對宿主細(xì)胞的感染性，將外源基因?qū)胩囟?xì)胞中，廣泛應(yīng)用于基因診斷和基因治療。,病毒載體系統(tǒng),.,病毒載體的優(yōu)勢,利用病毒天然的感染性進入細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高；病毒的宿主范圍廣，且具有高效的靶向特異性；病毒基因組的結(jié)構(gòu)簡單、分子背景比較清楚，穩(wěn)定易于改造、易于制備；復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成；不同的病毒載體具有不同的表達(dá)特點；通過載體改造的方式形成了復(fù)制缺陷型結(jié)構(gòu)，安全性高；病毒包裝技術(shù)經(jīng)歷了多年的研究，已趨于成熟，可用于產(chǎn)業(yè)化大量生產(chǎn),.,存在的問題,1、安全性：細(xì)胞毒性染色體毒性免疫毒性2、靶向性：轉(zhuǎn)導(dǎo)靶向性轉(zhuǎn)錄靶向性3、有效性：轉(zhuǎn)導(dǎo)效率基因表達(dá)水平和持續(xù)時間表達(dá)的可調(diào)控性,.,要求：1、攜帶外源基因并能包裝成感染性病毒顆粒2、介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)3、對機體不致病組成：1、病毒復(fù)制和包裝元件2、病毒基因3、插入的外源基因或元件4、病毒外殼/外膜,.,常用的病毒載體：腺病毒載體、慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體被包裝的DNA/RNA中不含任何病毒編碼基因，只保留其復(fù)制和包裝所必需的順式作用元件。獲得的重組病毒顆粒具有野生型病毒的外殼/外膜和感染性，但不表達(dá)病毒蛋白,.,.,.,腺病毒載體,無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，宿主范圍很廣，適用于在分裂或非分裂哺乳動物細(xì)胞中進行高效瞬時表達(dá)。除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤細(xì)胞，腺病毒系統(tǒng)可以在任何哺乳動物細(xì)胞中高效瞬時表達(dá)，是可靠的基因遞送平臺。它在感染宿主細(xì)胞時，病毒基因組及其攜帶的外源基因獨立于宿主基因組外游離表達(dá)，因此是無插入突變性，安全性高。腺病毒載體的外源基因裝載量較大，表達(dá)速度快，可獲得高滴度的病毒。可產(chǎn)生108pfu/ml原液，濃縮后可達(dá)1010-1011VP/ml，被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和基因治療中。,.,腺病毒系統(tǒng)的包裝,目的基因克隆至腺病毒穿梭質(zhì)粒（Pshuttle-CMV）將穿梭質(zhì)粒線性化后與腺病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入特定的大腸桿菌中通過Cre/loxP系統(tǒng)的作用進行同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒顆粒。將篩選到的重組腺病毒運用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中，利用帶有E1基因的293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，一至兩周即可包裝出E1缺失的腺病毒載體，通過倍比擴增，富集病毒顆粒。,.,慢病毒載體,慢病毒(lentivirus)屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retrovidae)，為RNA病毒。慢病毒核蛋白質(zhì)前整合復(fù)合物具有嗜核特性，病毒基因組通過順式作用元件運輸至細(xì)胞核，并將要表達(dá)的基因序列整合到細(xì)胞的基因組中，從而使慢病毒可以感染并在非有絲分裂細(xì)胞中復(fù)制,得到持續(xù)穩(wěn)定的高表達(dá)。這一特性使慢病毒成為基因治療的轉(zhuǎn)移載體。,.,慢病毒載體的特性,慢病毒載體由慢病毒為骨架改造而來可以高效率將目的基因整合到宿主細(xì)胞的染色體上可以感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞是理想的可以在多種細(xì)胞類型（如原代細(xì)胞、干細(xì)胞和非分裂細(xì)胞）中實現(xiàn)可重復(fù)的穩(wěn)定表達(dá)的基因表達(dá)工具,.,常見的慢病毒包括人免疫缺陷病毒(Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)、猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus,SIV)、馬傳染性貧血病毒（Equineinfectiousanemiavirus,EIAV）和貓免疫缺陷病毒（Felineimmunodeficiencyvirus,FIV）。,.,HIV-1,HIV-1為單鏈RNA病毒，共有9個基因。gag、pol、env3個基因編碼病毒的基本結(jié)構(gòu)，tat、rev為調(diào)節(jié)基因，vif、vpr、vpu、nef4個為輔助基因，編碼的蛋白則作為毒力因子參與宿主細(xì)胞的識別和感染。,gag-群抗原基因，編碼核心蛋白基質(zhì)蛋白、衣殼蛋白、核衣殼蛋白等pol-多聚酶基因，編碼病毒復(fù)制所需的酶，如反轉(zhuǎn)錄酶、整合酶、蛋白酶env-包膜蛋白基因，編碼包膜蛋白gp120及gp41，決定病毒感染宿主的靶向性tat-基因反式激活因子，參與HIV-1基因RNA轉(zhuǎn)錄的控制rev-病毒蛋白表達(dá)調(diào)節(jié)因子，能增加gag和env基因?qū)Y(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)vif-病毒感染因子,其作用是在一些細(xì)胞因子的協(xié)下促進HIV-1在細(xì)胞內(nèi)復(fù)Vpr-R蛋白能使HIV在巨噬細(xì)胞中增殖vpu-U蛋白，能促進HIV從細(xì)胞膜上釋放nef-負(fù)因子，具有抑制HIV-1增殖作用LTR-兩端長末端重復(fù)序列，內(nèi)含復(fù)制所需的順式作用元件，如包裝信號元件。,.,慢病毒載體系統(tǒng)組成,第一代慢病毒載體系統(tǒng)是以三質(zhì)粒系統(tǒng)為代表。該系統(tǒng)由包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒及載體質(zhì)粒3種質(zhì)粒組成。包裝部分HIV-1前病毒基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用元件,5端LTR由巨細(xì)胞病毒早期啟動子取代，3LTR由SV40polyA序列取代。,包裝載體,.,表達(dá)載體部分與包裝成分互補,僅含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV-1順式作用元件,5端LTR和全部5端非翻譯區(qū)域。包膜表達(dá)質(zhì)粒使用水皰性口炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)用來代替了原病毒的env基因。,表達(dá)載體,包膜載體,.,三代慢病毒載體,第二代慢病毒載體系統(tǒng)是在第一代的基礎(chǔ)上進行改進在包裝質(zhì)粒中刪除了HIV的所有輔助基因（vif、vpr、vpu和nef）不影響病毒的滴度和感染能力，同時增加了載體的安全性第三代慢病毒載體系統(tǒng)由四質(zhì)粒代替原有的三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)。將rev基因單獨放在一個包裝質(zhì)粒上。增加了兩個安全特性：一是構(gòu)建自身失活的慢病毒載體，即刪除了U3區(qū)的3LTR，使載體失去HIV-1增強子及啟動子序列；二是去除了tat基因，用異源啟動子序列代替，只保留了3個基因(gag、pol和rev)，更加安全。,.,lentivirus包裝流程,將293T細(xì)胞傳代至60%70%匯合時，用脂質(zhì)體法將4個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。體外培養(yǎng)24小時，熒光顯微鏡下觀察，大量細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，說明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。培養(yǎng)48小時后，用超速離心收獲含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液，濃縮后得到高滴度的慢病毒濃縮液。并進行感染293T細(xì)胞的實驗，感染4872小時后觀察到約有70%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白，說明病毒用很強的感染能力。將被感染細(xì)胞傳代1、2和3次，在傳代細(xì)胞中依然觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，說明包裝的慢病毒具備感染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的能力。,.,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,逆轉(zhuǎn)錄病毒即反轉(zhuǎn)錄病毒是一類RNA病毒，它能在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再經(jīng)過DNA復(fù)制/轉(zhuǎn)錄/翻譯等蛋白酶作用擴增形成病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA基因組整合在宿主染色體上的位點是隨機的。逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的整合是復(fù)制病毒RNA的必經(jīng)階段。只有當(dāng)受感染細(xì)胞處于細(xì)胞分裂期間，逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA基因組才能接觸到宿主細(xì)胞的遺傳物質(zhì)。因此，逆轉(zhuǎn)錄病毒只能在分裂中的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。,.,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點,優(yōu)點：轉(zhuǎn)染范圍廣，由于逆轉(zhuǎn)錄病毒的受體分布廣泛，可以感染各種細(xì)胞類型，如淋巴細(xì)胞或肝細(xì)胞、肌細(xì)胞等;轉(zhuǎn)入的外源基因可完全穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞染色體內(nèi)，使得目的基因長期穩(wěn)定表達(dá)；對細(xì)胞感染率高感染細(xì)胞不產(chǎn)生病變,可建立細(xì)胞系長期持續(xù)表達(dá)外源基因。局限性：只能感染分裂細(xì)胞；能夠插入的外源基因較小，難以滿足較大基因的轉(zhuǎn)移；載體DNA整合人宿主染色體是隨機的，并因隨機整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，從而具有引發(fā)癌癥的風(fēng)險；活體直接基因轉(zhuǎn)移對病毒滴度要求高，病毒活體直接注射會受到補體影響而滅活等問題。,.,逆轉(zhuǎn)錄病毒的親嗜性存在物種之間的差異，據(jù)此可將其分為三類：單嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（ectropicretrovirus），只感染小鼠和少數(shù)幾個品種的大鼠兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（amphotropicretrovius），能感染小鼠的細(xì)胞，也能感染其他種屬動物的細(xì)胞異嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒（xenotropicretrovirus），能感染多種動物細(xì)胞，但不能感染小鼠細(xì)胞目前使用較多的是兼嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒，即以兼嗜性包裝細(xì)胞包裝病毒顆粒。,.,逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝原理,早期逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)共由兩部分組成：包裝細(xì)胞系和逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中去除了病毒顆粒形成所必需的gag，pol和env基因，僅保留了復(fù)制和包裝信號。通過分子克隆技術(shù)將目的基因插入此載體上。而包裝細(xì)胞系能提供病毒載體包裝成病毒粒子所需的結(jié)構(gòu)蛋白gag、pol和env蛋白。,.,當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補作用共同完成病毒裝配，該病毒顆?？筛腥酒渌拗骷?xì)胞，此時目的基因進入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。宿主細(xì)胞不能像包裝細(xì)胞那樣為缺失結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒提供結(jié)構(gòu)蛋白，因而在宿主細(xì)胞內(nèi)不會產(chǎn)生新的感染性病毒顆粒，保證了該載體在生物制品領(lǐng)域的生物安全性問題。,.,第一代包裝細(xì)胞基因組整合了僅缺失包裝信號的MLV前病毒基因組，包裝的病毒顆粒為單嗜性。將其包膜蛋白env基因換成鼠4070A病毒的雙嗜性包膜蛋白，就產(chǎn)生了能分泌雙嗜性病毒的包裝細(xì)胞。但這個細(xì)胞系所含的包裝結(jié)構(gòu)僅僅缺失信號，只要它們與載體之間發(fā)生一次重組，就可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的野生型病毒，安全性很差。第二代包裝細(xì)胞前病毒基因組除了包裝信號缺失外，5LTR的5端順序也缺失，病毒剪接供體上游部位進一步缺失，3LTR被SV40的轉(zhuǎn)錄終止多聚腺苷酸信號取代。經(jīng)過這樣的改造，包裝細(xì)胞與載體系列之間的共同順序只存在于緊接gag起始密碼子上游53bp的區(qū)域。,.,這種包裝結(jié)構(gòu)與載體結(jié)構(gòu)至少經(jīng)過二次獨立的重組才能形成有復(fù)制能力的野生型病毒，使基因治療的安全性大大提高。但如用早期的載體進行包裝，經(jīng)長期培養(yǎng)后，仍有野生型病毒產(chǎn)生。第三代包裝細(xì)胞幾乎將基因載體和包裝細(xì)胞間重組產(chǎn)生的野生型病毒完全消除。包裝細(xì)胞含有二個互補的逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，二者均缺失包裝信號，且3LTR均被SV40的多聚腺苷酸化信號取代。但其中一個包裝結(jié)構(gòu)只含gag和pol基因，另一結(jié)構(gòu)只含有env基因，由二者聯(lián)合產(chǎn)生的蛋白質(zhì)供載體包裝。這類包裝細(xì)胞具有更高的安全性。,.,常見的包裝細(xì)胞系,.,目前常用逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)成：一個含有目的基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體；一個包膜蛋白載體；表達(dá)gag/pol的輔助質(zhì)粒；以及包裝細(xì)胞系。表達(dá)載體：去除了野生型病毒顆粒形成所必需的結(jié)構(gòu)基因，其基本結(jié)構(gòu)和特點為：(1)5LTR為CMV/MSV雜合啟動子，缺失一段序列的3LTR作為終止子，不會在體內(nèi)發(fā)生重組；(2)保留包裝信號+序列,促進高滴度病毒產(chǎn)生。；(3)去除了野生型病毒顆粒形成所必需的結(jié)構(gòu)基因，保證載體使用的安全性；(4)在目的基因后用內(nèi)部核糖體進入位點連接抗性基因，可以根據(jù)需要選擇不同的抗性；(5)重組病毒基因組的大小不能超過10kb，如果太大則無法包裝成病毒。,.,包膜蛋白載體逆轉(zhuǎn)錄病毒的宿主范圍由病毒顆粒表面的包膜蛋白(Env)決定，病毒基因組不影響其靶向性，不同的基因組可用相同的Env包被，且Env來自何種病毒，包裝出的病毒顆粒就叫該病毒的假病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒的包膜蛋白如10A1、GAP70和4070A等都不穩(wěn)定，其與細(xì)胞受體的結(jié)合部位容易受離心剪切力或其它機械力破壞。此外，由這些包膜蛋白參與組成的逆轉(zhuǎn)錄病毒在進入宿主細(xì)胞時需要經(jīng)過一個特異性的受體配體結(jié)合過程，由此決定了一種病毒只能感染一種或一類細(xì)胞，限制了逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用。包膜蛋白常用的載體主要有P10A1、pEco、pAmpo和口炎皰疹病毒-G蛋白（vesicularstomatitisvirusG,VSV-G）。,.,VSV-G因其具有更廣泛的宿主范圍和更高的轉(zhuǎn)染效率等優(yōu)點而成為組成逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)的最常用包膜蛋白載體。VSV-G的結(jié)構(gòu)比較簡單，在與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體共轉(zhuǎn)染到包裝細(xì)胞內(nèi)之后，VSV-G蛋白瞬時表達(dá)，調(diào)節(jié)病毒通過脂質(zhì)結(jié)合及質(zhì)膜融合，介導(dǎo)病毒進入細(xì)胞，將重組病毒RNA包裝成有感染力的病毒。,包膜蛋白載體pVSV-G,.,當(dāng)重組病毒載體導(dǎo)入包裝細(xì)胞后，缺陷病毒載體和包裝細(xì)胞的互補作用共同完成病毒裝配，該病毒顆粒可感染其他宿主細(xì)胞，此時目的基因進入該細(xì)胞并整合到細(xì)胞基因組中，導(dǎo)致插入序列在宿主細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生目的蛋白。,packing,.,逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝流程,.,1）構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：將目的基因片段連接至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；2）包裝細(xì)胞準(zhǔn)備和病毒包裝將293T細(xì)胞傳代到直徑10mm培養(yǎng)皿，細(xì)胞匯合度達(dá)到95%以上時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1小時將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液換為不含血清的新鮮DMEM。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將載體質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。3）病毒的收集轉(zhuǎn)染后48h后第一次收集病毒上清，72h后再收集一次。4）病毒的濃縮使用AmiconUltra-15centrifugalfilterdevices(100KNMWL)進行濃縮。直接用于小鼠細(xì)胞感染或分裝凍存于-80。,.,病毒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光檢測效果A：體外培養(yǎng)24h；B,C:4872h；D,E,F：感染細(xì)胞傳代后1代、2代、3代,.,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染流程：,1）準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；2）用含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，刺激細(xì)胞進入周期，有利于逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染；3）收集細(xì)胞，與病毒混合接種；4）培養(yǎng)細(xì)胞8-10h，更換不含病毒液的培養(yǎng)基；5）繼續(xù)培養(yǎng)12h后進行二次感染；6）第一次病毒感染72h后收集感染的細(xì)胞，進行流式分選。,.,病毒滴度的測定,滴度單位：TU/ml，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數(shù)?！盩U”為”tra