第三節(jié)(2)多肽和蛋白質(zhì)類藥物生產(chǎn)VIP

重組人干擾素生產(chǎn)工藝,主要內(nèi)容,干擾素概述基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏干擾素的發(fā)酵工藝過程干擾素的分離純化工藝過程,1.干擾素概述,干擾素的種類干擾素的理化性質(zhì)干擾素的生物學(xué)活性干擾素的臨床應(yīng)用干擾素的生產(chǎn)工藝路線,1.1干擾素的種類,概念：（interferon，IFN）干擾素是一種細(xì)胞因子，它是機(jī)體感染病毒時(shí)，宿主細(xì)胞通過抗病毒應(yīng)答反應(yīng)，而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能相近的低分子糖蛋白。英文名稱為Interferon，簡(jiǎn)稱IFN。發(fā)現(xiàn)：干擾素是1957年英國(guó)科學(xué)家Isaccs等發(fā)現(xiàn)的。他們把滅活的流感病毒作用于小雞細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞產(chǎn)生了一種可溶性物質(zhì)，這種物質(zhì)能抑制流感病毒，并且能干擾其它病毒的繁殖，因此，他們將這種物質(zhì)稱為“干擾素”。以后科學(xué)家們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，機(jī)體對(duì)入侵的異種核酸（包括病毒）都產(chǎn)生干擾素以進(jìn)行防御。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，機(jī)體細(xì)胞產(chǎn)生干擾素，干擾病毒復(fù)制，它是機(jī)體抗病毒感染的防御系統(tǒng)。,天然干擾素分類,1.根據(jù)來(lái)源、基因序列和氨基酸組成分類I型干擾素：IFN、IFN、IFN、IFN來(lái)源：白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、病毒感染的組織細(xì)胞等功能：抗病毒感染、抗腫瘤生長(zhǎng)免疫調(diào)節(jié)(較弱）其中IFN-為多基因產(chǎn)物，有23種以上的亞型。II型干擾素：干擾素（IFN)來(lái)源：活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生功能：免疫調(diào)節(jié)提高單核巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞的抗原提呈能力增強(qiáng)Tc細(xì)胞和NK細(xì)胞的殺傷活性抑制TH2細(xì)胞形成，下調(diào)體液免疫應(yīng)答趨化作用抗病毒和抗腫瘤作用（次要）2.根據(jù)動(dòng)物來(lái)源確定分類，例如人干擾素（HuIFN），小鼠干擾素（MuIFN）。,上市重組干擾素:2a、2b、1b、1b，1992年我國(guó)第一個(gè)基因工程藥物IFN-1b獲得國(guó)家一類新藥證書。研發(fā)中的重組干擾素：IFN，臨床階段,1.2干擾素的理化性質(zhì),143-166aa；MW:18-40ku；pI:6.5-7.5；乙醚、氯仿敏感容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維膜、瓊脂和塑料等介質(zhì)。,型干擾素具有廣譜的抗病毒活性，對(duì)多種病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但這種效應(yīng)不是直接的，而是通過對(duì)宿主細(xì)胞的作用引起的。對(duì)干擾素敏感的細(xì)胞表面存在于干擾素受體，核內(nèi)有“抗病毒蛋白”基因，受干擾素作用后該基因活化，產(chǎn)生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻譯，并促進(jìn)病毒mRNA降解。干擾素能提高細(xì)胞表面MHC類分子的表達(dá)水平，受到病毒感染的細(xì)胞表面MHC類分子的增加有助于向Tc細(xì)胞遞呈抗原，引起靶細(xì)胞的溶解。干擾素可增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)病毒感染的殺傷能力。,1.3干擾素的生物學(xué)活性,正常情況下組織或血清中不含干擾素，只有在某些特定因素的作用下才能誘使細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。,1.3.1廣譜抗病毒活性機(jī)制,病毒復(fù)制,抑制病毒復(fù)制,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),IFN-a,IFN-誘導(dǎo)蛋白,誘導(dǎo)刺激,胞核,胞核,抗腫瘤作用機(jī)制,型干擾素能抑制細(xì)胞的DNA合成，減慢細(xì)胞的有絲分裂速度；這種抑制作用有明顯的選擇性，對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用比對(duì)正常細(xì)胞的作用強(qiáng)5001000倍。另外，型干擾素也可通過增強(qiáng)機(jī)體免疫機(jī)制、加強(qiáng)免疫監(jiān)督功能來(lái)實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤效應(yīng)。,免疫調(diào)節(jié)活性機(jī)制,免疫調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)在對(duì)宿主免疫細(xì)胞活性的影響，如對(duì)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞等均有一定作用。對(duì)巨噬細(xì)胞的作用：IFN可使巨噬細(xì)胞表面MHC類分子的表達(dá)增加，增強(qiáng)其抗原遞呈能力；此外還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞表面表達(dá)Fc受體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬免疫復(fù)合物、抗體包被的病原體和腫瘤細(xì)胞。對(duì)淋巴細(xì)胞的作用：干擾素對(duì)淋巴細(xì)胞的作用較為復(fù)雜，可受劑量和時(shí)間等因素的影響而產(chǎn)生不同的效應(yīng)。在抗原致敏之前使用大劑量干擾素或?qū)⒏蓴_素與抗原同時(shí)投入會(huì)產(chǎn)生明顯的免疫抑制作用；而低劑量干擾素或在抗原致敏之后加入干擾素則能產(chǎn)生免疫增強(qiáng)的效果。在適宜的條件下，IFN對(duì)B細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的分化有促進(jìn)作用，但不能促進(jìn)其增殖。IFN能增強(qiáng)TH1細(xì)胞的活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能；但對(duì)TH2細(xì)胞的增殖有抑制作用，因此抑制體液免疫功能。IFN不僅抑制TH2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4，而且抑制IL-4對(duì)B細(xì)胞的作用，特別是抑制B細(xì)胞生成IgE。對(duì)其它細(xì)胞的作用：IFN對(duì)其他細(xì)胞也有廣泛影響：刺激中性粒細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力；活化NK細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞毒作用；使某些正常不表達(dá)MHC類分子的細(xì)胞（如血管內(nèi)皮細(xì)胞、某些上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞）表達(dá)MHC類分子，發(fā)揮抗原遞呈作用；使靜脈內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)中性粒細(xì)胞的粘附能力更強(qiáng)，且可分化為高內(nèi)皮靜脈，吸引循環(huán)的淋巴細(xì)胞。,1.4重組干擾素的臨床應(yīng)用,廣譜抗病毒活性（rhuIFN）慢性乙型、丙型、丁型肝炎；皰疹、病毒性角膜炎。直接抗腫瘤活性（rhuIFN）毛細(xì)胞和慢性髓樣白血病、Kaposi肉瘤、非霍奇金淋巴瘤。免疫調(diào)節(jié)活性治療慢性肉芽腫瘤（rhuIFN）多發(fā)性硬化癥rhuIFN,1.5.干擾素生產(chǎn)工藝路線（1）,體外誘生干擾素制備工藝：Sendai病毒誘導(dǎo)人白細(xì)胞1989年：IFN-n3/Alferon，批準(zhǔn)上市產(chǎn)量低：1gIFN，需要3億ml人血白細(xì)胞來(lái)源困難，工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴潛在的血源性病毒污染的可能性,干擾素生產(chǎn)工藝路線（2）,人源轉(zhuǎn)化細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：1999年：IFN-n1/Wellferon,批準(zhǔn)用于臨床。優(yōu)點(diǎn)：首次實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。缺點(diǎn)：活性低，退出臨床應(yīng)用。,干擾素生產(chǎn)工藝路線（3）,上市產(chǎn)品：重組人干擾素rhuIFN1986，rhuIFN-2a，rhuIFN-2b；1990，rhuIFN-1b；1993，rhuIFN-1b；20012002：PEG化IFN，PEG-Intron,Pegasys表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化，N-met，無(wú)活性包涵體工藝特點(diǎn)：發(fā)酵過程，隨后變性、復(fù)性過程。,基因工程大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝:,干擾素生產(chǎn)工藝路線（4）,上市產(chǎn)品：rhuIFN-1a1996，Avonex(Biogen)；2002，Rebif(Serono)表達(dá)產(chǎn)物：166aa糖基化蛋白，22.5ku工藝特點(diǎn)：分泌表達(dá)，產(chǎn)量低，成本高,過程嚴(yán)格,動(dòng)物無(wú)限細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)工藝：,干擾素生產(chǎn)工藝路線（5）,宿主：腐生型假單胞桿菌（Pseudomonasputida）上市產(chǎn)品：IFN-2b/安福隆表達(dá)產(chǎn)物：無(wú)糖基化可溶性蛋白質(zhì)，具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性工藝特點(diǎn)：發(fā)酵周期短：幾個(gè)小時(shí)無(wú)需變性、復(fù)性過程，獲得有活性產(chǎn)品純化過程：淘汰抗體親和層析,基因工程假單胞桿菌發(fā)酵生產(chǎn)工藝,2.基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建與保藏,基因工程假單胞桿菌菌種建立基因工程假單胞桿菌菌種特性菌種庫(kù)的建立與保藏,2.1、基因工程假單胞桿菌菌種建立,第一步：干擾素-2b基因的克隆第二步：表達(dá)載體的構(gòu)建第三步：工程菌的構(gòu)建,第一步：干擾素基因的克隆(RT-PCR),制備白細(xì)胞，病毒誘導(dǎo)，分離mRNA,反錄酶合成cDNA,PCR，基因連接質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化E.coli,篩選鑒定克隆。測(cè)序：編碼人IFN-2b基因序列,501bp，165aa。,第二步：表達(dá)載體構(gòu)建,IFN基因與表達(dá)載體連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選陽(yáng)性克隆獲得序列正確表達(dá)載體,第三步：工程菌構(gòu)建,轉(zhuǎn)化假單胞桿篩選高表達(dá)、穩(wěn)定遺傳的工程菌獲得原始菌種,2.2基因工程菌的特性,（1）具有宿主菌的特征：細(xì)菌：革蘭氏陰性菌，有莢膜，無(wú)芽孢，桿狀。菌落：直徑2.5-3.0mm，灰綠色半透明狀,粘稠。生化特性:Ser-，L-Val、D/L-Arg和L-Thr為（2）工程菌的特征：SmR、TcR、ApR（3）具有生產(chǎn)干擾素能力：放射性免疫學(xué)效價(jià)不低于2.0109IU/L。,2.3菌種庫(kù)的建立與保藏,QC：菌種特性、生產(chǎn)能力、質(zhì)粒穩(wěn)定性菌種檢查合格后，方可投產(chǎn)。,3.干擾素-2b的發(fā)酵工藝過程,3.1搖瓶培養(yǎng),取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30，pH7.0，250r/min，182h檢測(cè)：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。,3.2種子罐培養(yǎng),接種：接入50L種子罐，接種量10%。培養(yǎng)：30，pH7.0?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速DO為30%，34h，OD4.0。檢測(cè)：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。,3.3發(fā)酵罐培養(yǎng),接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%?？刂疲杭?jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。前4h：30，pH7.0，DO為30%。4h后：20，pH6.0，DO為60%，56.5h。終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.01.0，5冷卻水快速降溫至15以下。檢測(cè)：發(fā)酵液雜菌檢查,3.4菌體收集,連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液，16000r/min離心收集。菌體保存：20冰柜，不超過12個(gè)月。檢測(cè)：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。,4干擾素的分離純化工藝過程,4.1、干擾素分離工藝過程4.2、干擾素的純化工藝過程,4.1干擾素-2b分離工藝過程,菌體裂解預(yù)處理初級(jí)分離,(1)菌體裂解,裂解緩沖液：純化水配制，210（pH7.5）使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF（苯甲基磺酰氟）。破碎20菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，210，2hr凍融:細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。,(2)預(yù)處理-沉淀,加絮凝劑聚乙烯亞胺:210，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:210,攪拌15min，對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。,(3)離心,連續(xù)流離心機(jī)：210，16000r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121、30min蒸汽滅菌,焚燒處理。,（4）初級(jí)分離,鹽析:4M硫酸銨，210，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4保存。,4.2、干擾素純化工藝過程,溶解粗干擾素沉淀與疏水層析陰離子交換層析與濃縮陽(yáng)離子交換層析與濃縮凝膠過濾層析無(wú)菌過濾分裝,(1)溶解粗干擾素,配制純化緩沖液：超純水，pH7.5磷酸緩沖液，0.45m濾器和10ku超濾系統(tǒng)，百級(jí)層流下收集。冷卻至210。檢查:緩沖液的pH值和電導(dǎo)值。溶解：210，勻漿，完全溶解。,(2)沉淀與疏水層析,等電點(diǎn)沉淀（1）：磷酸調(diào)節(jié)至pH5.0，沉淀雜蛋白，離心收集上清液。疏水層析：干擾素吸附在疏水層析柱中除非疏水性蛋白洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）。,等電點(diǎn)沉淀（2）：磷酸調(diào)節(jié)pH4.5，調(diào)節(jié)電導(dǎo)值40ms/cm，210，靜置過夜超濾：1000ku超濾膜過濾，除去大蛋白。透析除鹽：調(diào)整溶液pH8.0，電導(dǎo)值，10ku超濾膜，0.005M緩沖液。,(3)陰離子交換層析與濃縮,0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）平衡樹脂。鹽濃度線性梯度550ms/cm進(jìn)行洗脫，配合SDS-PAGE收集干擾素峰。濃縮：調(diào)整溶液和電導(dǎo)，10ku超濾膜，0.05M醋酸緩沖液（pH5.0）中透析。,（4)陽(yáng)離子交換層析與濃縮,用0.1M醋酸緩沖液（pH5.0）平衡樹脂。上樣，相同緩沖液沖洗。鹽濃度線性梯度550ms/cm進(jìn)行洗脫配合SDS-PAGE收集干擾素峰。濃縮：10ku超濾膜進(jìn)行。,(5)凝膠過濾層析,洗滌液：0.15MNaCl的0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）清洗系統(tǒng)和樹脂上樣，相同緩沖液進(jìn)行洗脫。合并干擾素部分,(6)無(wú)菌過濾分裝,0.22m濾膜過濾干擾素溶液分裝20以下的冰箱中保存。,(7)檢測(cè)項(xiàng)目,干擾素鑒別試驗(yàn)干擾素效價(jià)測(cè)定蛋白質(zhì)含量，純度測(cè)定，分子量宿主殘余蛋白、殘余DNA干擾素結(jié)構(gòu)鑒定：紫外光譜，肽譜，N端序列其他：熱原，內(nèi)毒素，殘留抗生素,發(fā)酵法生產(chǎn)白細(xì)胞介素,白細(xì)胞介素的結(jié)構(gòu)與功能Interleukin，簡(jiǎn)稱IL。目前批準(zhǔn)上市的有IL-2、IL-6、IL-12等。,IL-2分子量為的糖蛋白，它刺激已被特異性抗原或致絲裂因數(shù)啟動(dòng)的細(xì)胞增殖。重組白介素可用于臨床研究。主要用于腎癌、黑色素瘤和非何杰金淋巴瘤有效（）。細(xì)胞代表個(gè)有單核巨噬細(xì)胞，和淋巴細(xì)胞特征的異原的細(xì)胞體。這些細(xì)胞似乎對(duì)癌細(xì)胞有特異作用。此外，細(xì)胞（不象細(xì)胞）介導(dǎo)殺傷不受的約束。,生產(chǎn)工藝1工藝流程圖,發(fā)酵,制備包涵體,洗滌與裂解,凝膠過濾與復(fù)性