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考馬斯亮藍(lán)G 250法測定蛋白質(zhì)含量 實驗?zāi)康?了解考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)的原理掌握考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量的操作步驟 實驗原理 考馬斯亮藍(lán)G250在酸性的溶液中游離狀態(tài)呈紅褐色 與蛋白質(zhì)結(jié)合后呈藍(lán)色 其最大吸收波長由465nm轉(zhuǎn)變?yōu)?95nm 在一定的蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi) 595nm處的光密度值與蛋白質(zhì)濃度成反比 可用比色法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量測定 儀器和試劑 1 儀器 分析天平 吸管0 1ml 1 1ml 2 5ml 1 試管10個 722型分光光度計 容量瓶100ml 1000ml各一個 2 試劑 1 0 9 NaCl溶液 2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 稱取10mg牛血清白蛋白 溶于蒸餾水并定容至100ml 制成0 1mg ml的原液 3 考馬斯亮藍(lán)G 250 0 01 染液 稱取0 1g考馬斯亮藍(lán)G 250 溶于50ml90 乙醇中 加入85 m v 的磷酸100ml 最后用蒸餾水定容至1000ml 此溶液不宜久存 在常溫中可放置1 2個月 4 樣品液 取牛血清白蛋白0 1mg ml的溶液 用0 9 NaCl溶液稀釋至一定濃度 操作步驟 1 0 100 g mL標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取6支試管 編號后 按下表加入試劑 混勻 室溫靜置5min后 以管1為空白對照 在595nm下比色測定 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量 g 為橫坐標(biāo) 吸光度為縱坐標(biāo) 繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線 2 樣品中蛋白質(zhì)含量的測定另取兩支干凈的試管 做一重復(fù) 加入合適濃度的待測樣品 使其測定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi) 測定方法同上 由樣品液的吸光度查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出含量 計算 樣品的蛋白質(zhì)含量 g g鮮重 查得的蛋白質(zhì)含量 g 樣品鮮重 g 注意事項 1 如果要求嚴(yán)格 最好在試劑加入后的5 20min內(nèi)測定光吸收 因為這段時間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的 2 測定中 蛋白 染料復(fù)合物會有少部分吸附于比色杯壁上 不可使用石英比色皿 因不易洗去染色 可用塑料或玻璃比色皿 使用后立即用少量95 的乙醇蕩洗 以洗去染色 塑料比色皿決不可用乙醇或丙酮長時間浸泡 思考題 1 說出你所知道的幾種蛋白質(zhì)定量測定的方法 并與考馬斯亮藍(lán)染色法相比較各有何優(yōu)缺點 2 根據(jù)下列所給的條件和要求 選擇一種或幾種常用的方法測定蛋白質(zhì)的濃度 1 樣品不易溶解 但要求結(jié)果較
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