使用oligo 6和primer premier 5.0等軟件設計pcr引物.doc

使用Oligo 6和Primer Premier 5.0等軟件設計PCR引物張新宇（中國醫(yī)科院腫瘤研究所，北京100021）電子郵件: 在當今分子生物學研究中，PCR技術已成為使用最多，最廣泛的技術之一。而引物設計是PCR技術中至關重要的一環(huán)。在PCR擴增以前，一般模板序列已被全部或部分確定。要想擴增出理想的目的片斷，一般都得通過正確設計PCR引物。也有的人不經過設計直接取模板序列的兩個片段作為引物，這樣很可能導致實驗失敗，如擴增出多條帶（引發(fā)錯配所致），不出目的帶或出目的帶很弱（引物引發(fā)效率低下），引物二聚體帶（引物與引物之間形成穩(wěn)定二聚體）等等?，F在PCR引物設計都通過計算機軟件進行。生物信息學發(fā)展至今日，具有引物設計功能的軟件有很多，其中大部分是免費軟件，可直接從網上下載，安裝并運行。這類軟件大都簡單易用，但其引物設計功能一般不很強，通過它們設計的引物常常不盡如人意，而專門進行引物設計的商業(yè)版軟件功能強大，但使用起來不太容易。本文就這一問題進行探討。引物設計的原則引物設計有幾條基本原則：首先引物要跟模板緊密結合，其次引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結構存在，再次引物不能在別的非目的位點引起DNA聚合反應(即錯配)。圍繞這幾條基本原則，設計引物需要考慮諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（product length），序列Tm值 (melting temperature)，G值(internal stability)，引物二聚體及發(fā)夾結構（duplex formation and hairpin），錯誤引發(fā)位點（false priming site），引物及產物GC含量（composition），有時還要對引物進行修飾，如增加限制酶切點，引進突變等。以使用Oligo軟件分析設計引物為例，筆者總結出以下的要點：1. 引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38，因為過長會導致其延伸溫度大于74，即Taq酶的最適溫度。2. 引物3端的序列要比5端重要。引物3端的堿基一般不用A，因為A在錯誤引發(fā)位點的引發(fā)效率相對比較高。另外引物間3端的互補、二聚體或發(fā)夾結構也可能導致PCR反應失敗。5端序列對PCR影響不大，因此常用來引進修飾位點或標記物。3. 引物的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。4. 引物所對應模板序列的Tm值最好在72左右。5. G值(自由能)反映了引物與模板結合的強弱程度。一般情況下，引物的G值最好呈正弦曲線形狀，即5端和中間G值較高，而3端G值相對較低，且不要超過9（G值為負值，這里取絕對值），如此則有利于正確引發(fā)反應而可防止錯誤引發(fā)。6. 可能的錯誤引發(fā)位點決定于引物序列組成與模板序列組成的相似性，相似性高則錯誤引發(fā)率高，錯誤引發(fā)的引發(fā)率一般不要高過100，如此可保證不出非目的產物的假帶。7. 引物二聚體及發(fā)夾結構的能量一般不要超過4.5，否則容易產生引物二聚體帶而且會降低引物濃度從而導致PCR正常反應不能進行，與二聚體相關的一個參數是堿基的分布，3端的連續(xù)GGG或CCC會導致錯誤引發(fā)。8. 對引物的修飾一般是增加酶切位點，應參考載體的限制酶識別序列確定，常常對上下游引物修飾的序列選用不同限制酶的識別序列，以有利于以后的工作。值得一提的是，各種模板的引物設計難度不一。有的模板本身條件較差，比如GC含量偏高或偏低，導致找不到各種指標都十分合適的引物；有時PCR產物要作為克隆對象插入到載體中表達，因此PCR引物設計的可選擇度很低。遇到這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件，這時，使用自動搜索引物及正確地評價引物可使研究人員對實驗心中有數。引物的自動搜索和評價分析帶有引物設計功能的軟件有很多，大都是For Windows版本的。在此特別推薦兩個專門性的引物設計軟件（商業(yè)版）：Primer Premier 5（以下簡稱Premier） 和 Oligo 5.0/6.22軟件的引物設計功能主要體現在兩個方面，首先是引物分析評價功能，該功能只有少數商業(yè)版軟件能夠做到，其中以Oligo 軟件最優(yōu)秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側重點不同，因此自動搜索的結果也不盡相同。據筆者的經驗，自動搜索功能以Premier 為最強且方便易用，Oligo軟件其次，其他軟件如Vector NTI Suit, Dnasis, Omiga, Dnastar都帶有引物自動搜索功能，但搜索結果不是十分理想。當然要想保證得到效果理想的引物，在自動搜索的基礎上，還要對引物輔以人工分析，以得到最佳設計的引物。因此，筆者認為引物設計軟件的最佳搭配是Oligo 和Premier 軟件一起，以Premier進行自動搜索，Oligo進行分析評價，如此可設計出成功率很高的引物。筆者曾以此搭配給多人設計引物，速度又快效果又好。Primer Premier 5.0的使用技巧1.功能簡介Premier的主要功能分四大塊，其中有三種功能較常用，即引物設計()，限制酶切點分析()，基元查找()。另個功能是同源性分析（），并非Premier的特長，在此略過。該軟件還有別的一些功能，如序列”朗讀”，DNA與蛋白序列的互換（），發(fā)聲提示鍵盤輸入（）等，但其中最優(yōu)秀的卻是能設計簡并引物。簡并引物的出現是出于遺傳密碼的簡并性。有時需要根據一段氨基酸的保守序列反推到DNA水平設計引物。眾所周知，大多數氨基酸（二十種常見結構氨基酸中的十八種）的遺傳密碼不只一種，因此，由氨基酸序列反推DNA序列時，就遇到部分堿基的不確定性。這種不確定性因物種或細胞亞結構的不同而異，比如在線粒體內的遺傳密碼與細胞核是不一樣的，甚至植物線粒體與無脊椎動物線粒體以及無脊椎動物線粒體的遺傳密碼都不盡相同。Premier可以針對各種不同的遺傳密碼規(guī)律設定不同的DNA和氨基酸的相互轉換，這取決于被分析序列的出處。這樣設計出來的引物實際上是多種序列的混和物，在某些位點有所變化，但大部分還是相同的，稱之為簡并引物。Primier軟件給出八種生物亞結構的不同遺傳密碼規(guī)則供用戶選擇，有纖毛蟲大核（Ciliate Macronuclear），無脊椎動物線粒體（Invertebrate Mitochondrion），支原體（Mycoplasma），植物線粒體（Plant Mitochondrion），原生動物線粒體（Protozoan Mitochondrion），一般標準（Standard），脊椎動物線粒體（Vertebrate Mitochondrion），和酵母線粒體（Yeast Mitochondrion）。2. 使用步驟及技巧Premier軟件的起動并打開一段序列后，界面如下：其主要功能在主界面上一目了然（按鈕功能如上述）。限制酶切點分析及基元查找功能比較簡單，點擊該功能按鈕后，選擇相應的限制酶或基元（如-10序列，-35序列等），按確定即可。常見的限制酶和基元一般都可以找到。你還可以編輯或者添加新限制酶或基元。進行引物設計時，點擊按鈕，界面如下：進一步點擊按鈕，出現search criteria窗口，有多種參數以調整。搜索目的（Seach For）有三種選項，PCR引物（PCR Primers），測序引物（Sequencing Primers），雜交探針（Hybridization Probes）。搜索類型(Search Type)可選擇上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer）都分別查找(Both)，或者成對查找（Pairs），或者分別以適合上、下游引物為主（Compatible With Sense/Anti-sense Primer）。另外還可改變選擇區(qū)域（Search Ranges），引物長度（Primer Length），選擇方式（Search Mode），參數選擇（Search Parameters）等等。研究人員可根據自己的需要設定各項參數。如果沒有特殊要求，建議使用默認設置。然后按，隨之出現的Search Progress窗口中顯示Search Completed時，再按，這時搜索結果以表格的形式出現，有三種顯示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成對顯示(Pairs)。默認顯示為成對方式，并按優(yōu)劣次序（Rating）排列，滿分為100，即各指標都能達標（如下圖）。點擊其中一對引物，如第1#引物，并把上述窗口挪開或退出，顯示Peimer Premier主窗口，如圖所示：該圖分三部分，最上面是圖示PCR模板及產物位置，中間是所選的上下游引物的一些性質，最下面是四種重要指標的分析，包括發(fā)夾結構（Hairpin），二聚體（Dimer），錯誤引發(fā)情況（False Priming），及上下游引物之間二聚體形成情況（Cross Dimer）。當所分析的引物有這四種結構的形成可能時，按鈕由變成，點擊該按鈕，在左下角的窗口中就會出現該結構的形成情況。一對理想的引物應當不存在任何一種上述結構，因此最好的情況是最下面的分析欄沒有，只有。值得注意的是中間一欄的末尾給出該引物的最佳退火溫度，可參考應用。有時需要對引物進行修飾編輯，如在5端加入限制酶切點，可點擊，然后修改引物序列。若要回到搜索結果中，則點擊按鈕。若要設計簡并引物，只需根據源氨基酸序列的物種來源選擇前述的八種遺傳密碼規(guī)則，反推至DNA序列即可。當然，對簡并引物的分析不能象一般引物那樣嚴格?？傊琍remier有優(yōu)秀的引物自動搜索功能，同時可進行部分指標的分析，使用也容易上手，是一個相當不錯的軟件。Oligo 6.22使用技巧1. 功能簡介在專門的引物設計軟件中，Oligo是最大名鼎鼎的。Oligo的使用并不十分復雜，但初學者容易被其復雜的圖表嚇倒。Oligo 5.0的初始界面是兩個圖：Tm圖和G圖；Oligo 6.22的界面更復雜，出現三個圖，加了個Frq圖，不知底細的人當然一看就蒙了。其實Oligo的主要功能集中在Analyze菜單里，只要把它弄懂了，其他的就很簡單了。Oligo的功能比Premier還要單一，就是引物設計。但它的引物分析功能如此強大以至于能風靡全世界。Oligo 6.22比Oligo 5.0的改進有，多序列共用引物設計，排除出現頻率高的序列片斷，搜索功能更加強大細致，改觀了界面等等。使用Oligo自動搜索引物也未嘗不可，尤其是6.22版本，引物搜索功能得到大幅提高，但在方便易用上稍不如Premier。2. 使用（以Oligo 6.22為例）Oligo 5.0的安裝有個需要注意的地方，安裝程序完畢后需要安裝一種字體，不然堿基顯示不清楚。在軟件安裝目錄（默認為C:oligo）的system下，有一個字體文件，oli.fon。打開控制面板，選”字體”“安裝新字體”，找到該路徑，安裝即可。Oligo 6.22可免去此步驟。起動Oligo 6.22并打開一個序列后，界面如下：圖中顯示的三個指標為Tm，G，Frq，其中Frq為6.22的新功能，為鄰近6至7個堿基組成的亞單位在一個指定數據庫文件中的出現頻率。該頻率高則可增加錯誤引發(fā)的可能性。因為分析要涉及多個指標，起動窗口的cascade排列方式不太方便，可從windows菜單改為tile方式。如果覺得太擁擠，可去掉一個指標，如Frq，這樣界面的結構同于Oligo 5.0，只是顯示更清楚了。經過Windows/Tile項后的顯示如圖：在設計時，可依據圖上三種指標的信息選取序列，如果覺得合適，可點擊Tm圖塊上左下角的Upper按鈕，選好上游引物，此時該按鈕變成，表示上游引物已選取好。下游引物的選取步驟基本同上，只是按鈕變成Lower。G值反映了序列與模板的結合強度，最好引物的G值在5端和中間值比較高，而在3端相對低（不要超過9如圖：） Tm值曲線以選取72度附近為佳，5到3的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應。Frq曲線為Oligo6新引進的一個指標，揭示了序列片斷存在的重復機率大小。選取引物時，宜選用Frq值相對較低的片斷。當上下游引物全選好以后，需要對引物進行評價并根據評價對引物進行修改。首先需要檢查的是引物二聚體尤其是3端二聚體形成的可能性。需要注意的是，引物二聚體有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之間形成（cross dimer）。二聚體形成的能值越高越穩(wěn)定，越不符合要求。對于一般的檢測（非克?。┬訮CR，對引物位置，產物大小要求較低，應盡可能選取不形成二聚體或其能值較低的引物。檢測的第二項是發(fā)夾結構（hairpin）。與二聚體相同，發(fā)夾結構的能值越低越好，一般來說，這兩項結構的能值以不超過4.5為好。當然，在設計克隆PCR引物時，引物兩端一般都添加酶切點，必然存在發(fā)夾結構，而且能值不會太低，這種PCR需要靈活調控退火溫度以達到最好效果，對引物的發(fā)夾結構的檢測就不應要求太高。檢測的第三項為GC含量，以45-55為宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，導致引物的GC含量不能在上述范圍內，這時應盡量使上下游引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火溫度的選擇。如果不是在基因組中進行PCR，而是一個特定模板序列，那么最好還進行一下False priming site的檢測。這項檢測可以看出引物在非目的位點引發(fā)PCR反應的可能性。一般在錯誤位點的引發(fā)效率以不超過100為好，但對于特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發(fā)效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發(fā)效率為450以上，而在錯誤位點的引發(fā)效率為130，并且不好找其他更合適的引物，那么這對引物也是可以接受的。如果引物在錯誤位點的引發(fā)效率比較高，PCR結果就可能出假陽性，這當然是我們不愿看到的。當我們結束以上四項檢測，按Alt+P鍵就出來PCR窗口，其中總結性地給出該引物的位置，產物大小，Tm值等參數，最有用的是還給出了推薦的最佳退火溫度和簡單的評價。關于Oligo軟件的引物自動搜索功能，因為與Primer Premier 5類似，并且似乎并不比它更好用，在此不再冗述。其實使用軟件自動搜索引物就是讓計算機按照人的要求去尋找最佳引物，如果參數設置得當將大大提高工作效率。Oligo6.0 的Memory Table功能：The oligo position displayed at the bottom of the Internal Stability window. The individual squares indicate positions on the active sequence. A marked nucleotide appears as a blue square and represents a position in the R1-R3 memory tables. It usually represents the 5-end of the selected positive strand primers (top sequence = R1) and 3-end of the selected negative strand primers (sequence in the middle = R2) in