ELISA試劑及溶液配制及實(shí)驗(yàn)步驟

ELISA試劑及溶液配制包被液：0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)0.75g碳酸鈉,1.46g碳酸氫鈉,加去離子水定容至500ml。0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)0.2g磷酸二氫鉀，2.90g磷酸氫二鈉，8g氯化鈉，加去離子水定容到1000ml?？贵w稀釋液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.2%BSA0.2gBSA加配好的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液溶解定量至100g。封閉液：0.05mol/L碳酸鹽緩沖液(pH9.6)+2.0%BSA2.0gBSA加配好的0.05mol/L碳酸鹽緩沖液溶解定量至100g。洗滌液：0.02mol/L PBS(pH7.4)+0.05%Tween-20將50ulTween-20溶入100ml0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中，震蕩混勻。顯色液：TMB-過氧化氫尿素溶液A液(3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺，TMB):稱取TMB20mg溶于10ml無水乙醇中，完全溶解后，加雙蒸水至100ml。B液(0.1mol/L檸檬酸-0.2mol/L磷酸氫二鈉緩沖液，pH5.0-5.4):稱取Na2HPO412H2O14.34g，檸檬酸1.87g溶于180ml雙蒸水，加0.75%過氧化氫尿素1.28ml，定容至200ml，調(diào)pH至5.0-5.4。將A液和B液按1：l混合后即成TMB-過氧化氫尿素應(yīng)用液。終止液：2mol/L H2SO4溶液10ml98%濃硫酸加入60ml雙蒸水中，定容至100ml，室溫保存。酶標(biāo)二抗：HRP標(biāo)記的羊抗兔 IgG，應(yīng)用時(shí)用抗體稀釋液稀釋3000倍。 2.2.6 抗血清的分離采集血液后，去掉針頭，緩慢注入已經(jīng)滅菌的三角燒瓶中，待凝固后用滅菌滴管將血液沿邊緣剝離，室溫放置1小時(shí)，再放入4冰箱過夜(不能冰凍，否則產(chǎn)生溶血)，使血清充分析出。第二天取出后以43000r/min離心30min，取上清，分裝后-20保存?zhèn)溆谩?.2.7 間接ELISA法檢測(cè)家兔抗血清效價(jià)(1)抗原包被用包被液(0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，pH9.6)把抗原稀釋為0.01mg/ml，將稀釋好的抗原液于每個(gè)酶標(biāo)板孔中加入100l。把酶標(biāo)板置入濕盒內(nèi)，于4包被過夜。(2)洗板棄去包被液，用洗滌液加滿所有酶標(biāo)孔，用紗布和衛(wèi)生紙包住扣干。1次，末次將水扣干。(3)封閉 在酶聯(lián)板上每孔加入250l封閉液(pH9.6， 0.05mol/L碳酸鹽緩沖液含2.0%BSA)，將酶聯(lián)板置于濕盒內(nèi)，4孵育過夜。也可37孵育2h。(4)棄去封閉液，洗滌1次同上。(5)加一抗(家兔抗血清)將免疫小鼠抗血清10l 加到990l 的抗體稀釋液中制成1:100的抗血清。(于1.5ml的EP管中操作)。給酶標(biāo)板上A行的1號(hào)孔加100l的1:100的血清。給酶標(biāo)板上A行的2到12孔各加入抗體稀釋液100 l，然后給A組的第二孔加入100l 1:100的抗血清，吹吸十次后吸取100l的血清加到第三孔，再吹吸十次取100l加到第四孔，依次加到第12孔，最后從第十二孔中吸出100l舍棄。這樣每孔均為100l，經(jīng)過11次二倍稀釋，血清稀釋度為1:204800。B、C行同上操作。給D行的前兩個(gè)孔只加入100l的抗體稀釋液做為空白對(duì)照，3-4孔加入100l稀釋100倍的陰性血，5-6孔不加抗原，只用封閉液封閉，每孔加入100l稀釋100倍的抗血清作對(duì)照。加完后將酶連板放在濕盒內(nèi)37孵育1h。(6)洗滌同上。(7)加酶標(biāo)二抗各孔加入稀釋倍數(shù)為1:3000的酶標(biāo)二抗（羊抗兔）100l，37濕盒內(nèi)孵育1h。(8)洗滌同上(9)顯色每孔各加A，B液50l后將酶連板放入濕盒內(nèi)避光3mi