液態(tài)芯片技術.docx

液態(tài)芯片技術 首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院 張國軍 1991 年 Foder 等人在 Science 雜志上首次提出生物芯片的概念。 1995 年， Schena 等在 Science 上報道， 45 個擬南芥基因固定在一張玻片上檢測表達，這是第一次生物芯片真正意義上應用。 1998 年 , 美國科學促進會將生物芯片技術評為十大科技突破之一。 一、生物芯片的定義和分類 生物芯片是指能快速并行處理多個生物樣品并對其所包含的各種生物信息進行解析的微型器件，它的加工運用了微電子工業(yè)中十分成熟的光刻技術和微機電系統(tǒng)加工中所采用的各種方法，只是由于其所處理和分析的對象是生物樣品，故稱之為生物芯片。生物芯片能對小分子、生物大分子、細胞、組織和微小生物等進行高通量快速、并行處理和分析。 根據(jù)結(jié)構(gòu)，生物芯片可分為由生物材料微陣列構(gòu)成的芯片和以各種微結(jié)構(gòu)為基礎的微流控芯片。生物材料微陣列構(gòu)成的芯片包括 DNA 芯片、蛋白質(zhì)芯片、組織芯片等，其工作原理是抗原抗體結(jié)合、核酸分子的堿基配對的作用，因此也為親和生物芯片；以各種微結(jié)構(gòu)為基礎的微流控芯片包括毛細管電泳芯片、 PCR 的反應芯片、介電電泳芯片等。 二、生物芯片概況 電子芯片和生物芯片被稱為 20 世紀最偉大的兩個發(fā)現(xiàn)。生物芯片是分子生物學和信息學的結(jié)晶。根據(jù)其基材的不同大致可分為玻璃片芯片、膜基芯片、硅基芯片、光纖芯片等。它們的共同的特點是在固態(tài)基材上極小的面積里合成或固定上許多核酸或蛋白探針，使芯片上的每個或幾個點代表一個基因或蛋白。利用生物芯片，科學家們可以通過一個實驗對成千上萬的基因或蛋白指標進行分析。生物芯片已成為生命科學領域中非常重要的手段。但遺憾的是，這些芯片的致命弱點就是其信息質(zhì)量的穩(wěn)定性和可重復性比較差，操作也較繁瑣。正因為如此，芯片臨床應用受到了很大的限制。 美國 Luminex 公司開發(fā)的液態(tài)芯片系統(tǒng)克服了這個缺點，成為正在崛起的一種標準化的新一代生物芯片技術平臺，既能為后基因組時代的科學研究提供強大的技術支持，又能作為高通量的新一代分子診斷技術平臺在臨床分子診斷領域大顯身手。 三、液態(tài)芯片簡介 美國 Luminex 公司開發(fā)出的液態(tài)芯片技術平臺是一種全新概念的生物芯片。該技術的核心是把微小的乳膠顆粒（ 5.6um ）用熒光染色的方法進行編碼，每種顏色的微粒（或稱為熒光編碼微粒）代表一種檢測標志物。應用時，把針對不同檢測物的彩色編碼微?；旌虾笤偌尤胛⒘坎∪藰吮?，在懸液中靶分子與微粒進行特異性地結(jié)合。最后用激光流式儀判定后由電腦以數(shù)據(jù)信息的形式記錄下來。因為分子雜交或免疫反應是在懸浮溶液中進行，檢測速度極快，而且可以一個微量液態(tài)反應體系中同時檢測 100 個指標。 Luminex 公司稱之為 “xMap” 技術。該儀器在我國 SFDA 進口注冊時被稱為 “ 多功能流式點陣儀 ” 。 液態(tài)芯片是真正的臨床應用型芯片，是基因信息時代的生物精華。 （一）液態(tài)芯片的概念和特點：液態(tài)芯片技術是在有色微球、激光技術、應用流體學及高速數(shù)字信號處理技術的基礎上發(fā)展起來的一種多功能的液相分析平臺。 液態(tài)芯片技術平臺應用非常廣泛，編碼微粒上可以包被蛋白也可以連接核酸，所以液態(tài)芯片既可以用來檢測蛋白（蛋白芯片），也可以檢測核酸變化（基因芯片）。 液態(tài)芯片的特點是高靈敏性，可以達到 0.01pg ；高通量，適應 96 孔板；高重復性， CV 值小于 5 ；操作簡單。 （二）液態(tài)芯片的原理：如（ ppt13 ）圖片所示，首先 把微小的乳膠顆粒（ Beads, 微球）分別染成不同的（多達 100 種）熒光色，然后把針對不同檢測物的核酸（互補鏈）或蛋白（如抗原抗體）以共價方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應用時，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測物（血清中的抗原、抗體、酶或 PCR 產(chǎn)物等），在懸液中的微球與被檢測物特異性地結(jié)合，并加上熒光標記。檢測時，微球成單列通過兩束激光，一束判定微球的顏色從而決定被測物的特異性（定性）；另一束測定微球上的熒光標記強度從而決定被測物的量（定量）。所得到的數(shù)據(jù)經(jīng)電腦處理后可以直接用來判斷結(jié)果。 液態(tài)芯片技術原理的核心：在聚苯乙烯微球內(nèi)部通過使用 2 種熒光配比染色的方法可以進行 100 余種編碼組合；每種熒光編碼微球分別共價包被特異的基因探針或抗體、抗原、蛋白探針來特異結(jié)合待測樣本中的靶向分子反應體系中靶向分子同時被標記上相應的報告熒光；最后通過流式細胞技術分離懸浮反應體系中編碼微球，并使得單個的編碼微球依次通過測量區(qū)域；測量區(qū)域是激光和液流交匯之處，報告熒光物質(zhì)和微球內(nèi)的編碼熒光物質(zhì)分別受到定量激光激發(fā)和定性激光激發(fā)，激發(fā)后光信號轉(zhuǎn)化為電信號；通過計算機的分析處理，確定微球結(jié)合的分析物的定性和定量信息。液態(tài)芯片的核心技術及其機理圖如（ ppt16-25 ）圖片所示。從而促進反應體系效率上來講，液態(tài)芯片分子雜交或免疫反應在懸浮溶液中進行，編碼微球的探針和靶向分子都在懸浮的三維體系中，故反應速度和反應效率得到最大程度上的提升。所用的時間縮短到半小時，靈敏度可達 0 01Pg 。在特異性方面，激光只分析微球一定半徑內(nèi)的信息，檢測特異性強，背景低?？赏瑫r得到液體芯片檢測技術平臺的定性和定量指標而無交叉影響。此技術可開展不同類型的工作，如微生物鑒定、免疫分析、核酸序列研究、酶學分析、受體和配體識別分析等。與傳統(tǒng)方法相比可極大的提高標本利用率，患者的 1 份標本可以被用來同時檢測多達 100 種生理、病理指標。 （三）液態(tài)芯片的優(yōu)點：液態(tài)芯片的獨特設計使得它擁有常規(guī)的檢測方法所不具備的特點。 1. 高效：因為許多顏色的乳膠顆?？梢苑旁谕粋€反應體系內(nèi)，所以一次可同時檢測多種（ 100 種）生理病理指標。這與傳統(tǒng)逐個檢測的方式效率有很大的不同。 2. 高敏感：每個乳膠微粒上都以共價結(jié)合的方式包被上許多抗原、抗體或核酸分子，因其參與反應的分子多，產(chǎn)生的信號就強。具 Qiagen 公司的報道，用該平臺檢測 IL 8 時，其靈敏度為 0.01pg ，達到了非常驚人的水平。 3. 快速：因為雜交或免疫反應在懸浮的液相中進行，所以反應需要時間短，雜交后常不用清洗就可以直接讀數(shù)，所以檢測效率大大高于固相雜交。所用時間從幾小時縮短到十幾分鐘。 4. 重復性好：固相芯片不能很好地應用于臨床診斷，其中一個重要的原因是其重復性差。這是固液雜交方式的芯片目前難以克服的技術障礙。但液態(tài)芯片雜交發(fā)生在均相的液體環(huán)境中，其結(jié)果穩(wěn)定，重復性非常好。另外，每個指標在一個反應體系中有 1000 5000 顆相同的微粒。檢測時，抽取其中的 100 500 顆讀數(shù)，最終的數(shù)據(jù)是取其均值，這樣已經(jīng)把誤差減到最小。相比固相芯片每個指標只有 1 2 個數(shù)據(jù)，其數(shù)據(jù)的可靠性就會差很多。 5. 唯一被 FDA 批準用于臨床診斷的生物芯片：具不完全統(tǒng)計，目前已有 4 家美國公司基于液態(tài)芯片技術平臺的產(chǎn)品獲得 FDA 的批準用于臨床診斷。他們分別是 ZeusScientific 公司開發(fā)的 AtheNAMulti-Lyte 芯片用于自身免疫病 9 種抗體檢測， INOVA 公司開發(fā)的也是應用于自身免疫病檢測的液態(tài)芯片， One Lamda 公司和 Lifecode 公司開發(fā)的 HLA 分型液態(tài)芯片 。 四、液態(tài)芯片的應用 在液態(tài)芯片平臺上可以開發(fā)許多產(chǎn)品，根據(jù)檢測機理的不同，可大致分成蛋白芯片和基因芯片兩大類。蛋白芯片基于的原理是抗原抗體的特異性相互作用，它所檢測的目標物是蛋白；基因芯片基于的原理是核酸分子雜交，它所檢測的目標物是核酸。國外目前有 20 余家公司正在研究基于液態(tài)芯片技術的產(chǎn)品，涉及的領域主要有 過敏原的篩查、細胞因子的檢測、腫瘤標志物的檢測、感染性疾病的抗原或抗體的檢測、心血管標志物的檢測、組織分型以及激酶和磷酸化等。 （一）艾芯：其中 AFP 、 CEA 、 CA125 、 NSE 、 CYFRA211 、 FPSA 、 TPSA 、 FSCG 、 CA242 九個指標只需要 20ul 的血清一次就可以測定出。涵蓋了中國人群高發(fā)腫瘤的 85% ，強調(diào)了對最高發(fā)腫瘤肺癌的指標選擇。采用液態(tài)芯片技術，高效、準確，節(jié)約了 30% 以上的費用和 50% 以上的時間。艾芯多指標檢測平臺被國際上認可。剔除了鐵蛋白、 HGH 等指標，新增最佳肺癌指標 cyfra21 1 ，肺癌的檢出率從 50 提高到 90 以上。 （二）肺芯：肺癌為國內(nèi)發(fā)病率最高的腫瘤。肺癌的輔助診斷 4 項組合 CEA 、 CA125 、 NSE 、 Cyfra21-1 為歐洲腫瘤標志物組織（ EGTM ）推薦的肺癌黃金組。其中 Cyfra21-1 是肺癌最佳指標，單指標檢出率大于 65% ，聯(lián)合檢測檢出率提高到 90% 以上。 （三）消芯：消化系統(tǒng)腫瘤占國內(nèi)腫瘤發(fā)病率 50% 以上，針對肝癌、膽囊癌、胰腺癌、食道癌、胃結(jié)腸癌，最精選的 5 個指標為 CEA 、 CA125 、 AFP 、 CA242 、 Cyfra21-1 。其中 Cyfra21-1 也是食道癌最敏感指標； CEA 和 CA242 是目前為胃結(jié)腸癌的最佳指標組合；新一代的 CA242 比 CA199 在胰腺癌、膽囊癌和消化道癌中假陽性更少。消芯的應用，使消化系統(tǒng)腫瘤診斷的準確率從單指標的 30-80% 提高到聯(lián)合檢測的 75-95% 。 （四）婦芯：是針對卵巢癌、宮頸癌、絨毛膜癌、乳腺癌、惡性畸胎瘤等設計的一種液態(tài)芯片。包含的指標有 CEA 、 CA125 、 AFP 、 Cyfra21-1 和 Free-betaHCG 。其中 CA125 是卵巢癌最佳指標，檢出率大于 75% ； AFP 是卵巢內(nèi)胚竇瘤最好指標。 Cyfra21-1 在宮頸癌的檢測中比 SCCA 更敏感。 （五） 懸浮微陣列檢測 HPV 基因型 1.HPV 的生物學性狀及分型： HPV 是一種嗜上皮性病毒，在人和動物中廣泛分布。 HPV 感染是當前發(fā)病率最高的性傳播疾病之一，可以引起包括外生殖器尖銳濕疣、宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變及宮頸癌等多種生殖系統(tǒng)疾病。 HPV 病毒屬于乳多空病毒科，無包膜，直徑 45 55nm ，有 9 個開放性回讀框架， E1 到 E7 為早期基因轉(zhuǎn)錄區(qū)， L1 和 L2 為晚期基因轉(zhuǎn)錄區(qū)。 HPV 可以分為高危型、可能是高危型或者中危型和低危型，（ ppt40 ）圖片顯示的是各種病變及其對應的 HPV 亞型。 2.HPV 與宮頸癌的關系：約 80 的宮頸癌與高危型 HPV 相關，其中以 16 ， 18 型呈高度相關性。 HPV 的感染類型與宮頸癌的組織學分型有關， HPVl6 型多見于宮頸鱗癌，而 HPVl8 型則主要見于宮頸腺癌，兩者均與相應組織分型的宮頸癌預后均密切相關， HPVDNA 陽性者，其預后相對較差。宮頸癌中 90 以上的病例可以檢測到 HPV 感染， HPV 的檢出率及類型因不同國家和地區(qū)、不同標本來源以及不同檢測方法而有所差異。持續(xù)性高危型 HPV 感染是 CIN 進展的重要條件，因此，對 HPV 感染進行準確的檢測可提高宮頸癌前病變篩查的敏感性。 3.HPV 分型懸浮微陣列的優(yōu)點：采用通用引物方法和液態(tài)芯片檢測平臺，一次擴增即可以擴增多種亞型，一次檢測即可區(qū)分 26 種亞型。靈敏度高，檢測低限僅為 6-10copy/ml ，陽性信號和陰性信號比值高，容易判讀。檢測快，雜交反應只需要 15min ，而傳統(tǒng)的雜交方法至少需要 2h ?？?96 孔板操作，適合于大規(guī)模篩查。方法簡單、效率高，敏感度高，特異性強、重復性好，適合于大樣本篩查，是最有效最準確的宮頸癌早期檢測手段。 五、總結(jié) 液相芯片檢測系統(tǒng)具有高通量、靈敏、準確、簡單、快速、標本量少等優(yōu)點，是極具優(yōu)勢的新一代檢測技術。聯(lián)合檢測多種腫瘤標志物的液相芯片克服了傳統(tǒng)免疫檢測方法一次只能檢測一項指標的缺點，真正實現(xiàn)高通量、多樣本的快速檢測，使臨床醫(yī)生和患者全面了解機體健康狀況，有助于發(fā)現(xiàn)早期腫瘤，提供腫瘤診斷的陽性率、特異性、準確性，為臨床提供早期診斷治療的依據(jù)。其聯(lián)合檢測中的應用模式可歸納為微球編碼、共價交聯(lián)、結(jié)合反應、激光檢測。 在生物科技商業(yè)化的背景下，國外知名大公司紛紛進行懸浮芯片的研發(fā)，給臨床醫(yī)學和檢驗醫(yī)學的發(fā)展帶來新的亮點；同時在研究方面，給了研究者更大的選擇余地。雖然懸浮芯片在多個生物醫(yī)學的領域中具有明顯的優(yōu)勢，但是在基因表達譜分析、基因診斷、獲得的基因信息量等方面，仍然無法和傳統(tǒng)的基因芯片相比。懸浮芯片最大的缺點是不能連續(xù)在線監(jiān)測待測樣品中靶標物