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第二章微生物農(nóng)藥昆蟲(chóng)數(shù)量和種類(lèi)很多危害農(nóng)作物 傳播疾病等無(wú)機(jī)和有機(jī)砷化物ddt 20世紀(jì)40年代 作用于昆蟲(chóng)神經(jīng)與肌肉組織殺滅多種昆蟲(chóng) 我國(guó)每年因病蟲(chóng)草鼠害造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)500億元 如果不使用農(nóng)藥農(nóng)作物糧食會(huì)損失50 使用農(nóng)藥防治則挽回?fù)p失的15 90年代我國(guó)農(nóng)藥生產(chǎn)已躍居世界第二位 眾所周知 化學(xué)農(nóng)藥在人類(lèi)戰(zhàn)勝病蟲(chóng)害中曾經(jīng)起到不可估量的作用 但也給人們帶來(lái)了不少 麻煩 最典型的要算ddt 1939年瑞士化學(xué)家米勒發(fā)現(xiàn)了這種化學(xué)物質(zhì)的強(qiáng)大殺蟲(chóng)能力 1943年盟軍占領(lǐng)意大利那不勒斯 遭到斑疹傷寒 虱子的威脅 司令部下令 所有的軍人和老百姓必須在大街上接受ddt溶液噴灑 果然虱子全滅 疾病絕跡 此后 它成了消滅蚊蠅 預(yù)防傳染病 殺滅某些農(nóng)作物害蟲(chóng)的主要藥物 米勒也因此獲得了1948年度諾貝爾生物和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng) 如今 這種曾一度風(fēng)光的化學(xué)物品被國(guó)際社會(huì)打入 冷宮 禁止生產(chǎn)和使用 原因是它具有高度穩(wěn)定性 生物難以降解而積累于體內(nèi) 還有的殘留于水源 大氣 土壤中 不僅危害動(dòng)植物本身 甚至直接或間接進(jìn)入人體 殃及我們的健康和生命 危害主要表現(xiàn)為 1 有機(jī)氯農(nóng)藥不僅對(duì)害蟲(chóng)有殺傷毒害作用 同時(shí)對(duì)害蟲(chóng)的 天敵 及傳粉昆蟲(chóng)等益蟲(chóng)益鳥(niǎo)也有殺傷作用 因而破壞了自然界的生態(tài)平衡 例如瓢蟲(chóng) 草蛉 食蚜蠅 食蟲(chóng)椿象的大量死亡 使蚜蟲(chóng) 紅蜘蛛等害蟲(chóng)的繁殖速度大增 2 長(zhǎng)期使用同類(lèi)型農(nóng)藥 使害蟲(chóng)產(chǎn)生了抗藥性 因而增加了農(nóng)藥的使用量與防治次數(shù) 也大大增加了防治費(fèi)用與成本 近些年 棉鈴蟲(chóng)對(duì)溴氫菊酯的抗藥性已增加到55 89倍 3 長(zhǎng)期大量使用農(nóng)藥 使農(nóng)藥在環(huán)境中逐漸積累 尤其是在土壤中 產(chǎn)生了農(nóng)藥污染環(huán)境問(wèn)題 4 農(nóng)藥被農(nóng)作物吸收 進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi) 經(jīng)過(guò)生物富集濃縮 使其毒性更大 這就不僅使得害蟲(chóng)的天敵更易受到毒害作用 而且會(huì)通過(guò)食物鏈威脅人體的健康 導(dǎo)致慢性中毒 有機(jī)氯農(nóng)藥積累干人體內(nèi)脂肪 肝臟 腎臟 損害肝腎功能 引起貧血 血細(xì)胞增多和中摳神經(jīng)性病變 也可能致畸和致癌 有機(jī)磷農(nóng)藥可以引起細(xì)胞遺傳物質(zhì)大改變 有致突變或致癌作用 全球每年有500萬(wàn)人因接觸化學(xué)農(nóng)藥和誤食而死亡 我國(guó)農(nóng)村兒童白血病患者近50 的誘因是化學(xué)農(nóng)藥 20世紀(jì)90年代 我國(guó)雖然已禁用ddt10年 但對(duì)南方某市52名哺乳婦女母乳ddt的檢出率竟然為100 1984年12月3日印度博帕爾事件液態(tài)劇毒性異氰酸甲酯 制造農(nóng)藥西維因和涕滅威的原料 生物農(nóng)藥步伐緩慢原因 1 生物農(nóng)藥具有無(wú)毒副作用 不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn) 但與化學(xué)農(nóng)藥相比有一個(gè)明顯的缺點(diǎn) 即施用之后藥效反應(yīng)慢 而且穩(wěn)定性也較差 特別是活體微生物為有效成分的產(chǎn)品 生物活性下降很快 產(chǎn)品的質(zhì)量保證期短 就農(nóng)民的用藥心理而言 希望施用農(nóng)藥后藥到蟲(chóng)除 而生物農(nóng)藥多數(shù)要在三四天后才能見(jiàn)到效果 因此 難以適應(yīng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)快速除蟲(chóng)的需要 2 生物農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)一般規(guī)模較小 廠房簡(jiǎn)陋 設(shè)備落后 資金短缺 由此而導(dǎo)致成本偏高 在價(jià)格上無(wú)優(yōu)勢(shì) 我國(guó)現(xiàn)有農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)2000多家 其中生物農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)約400家 但是規(guī)模較大的生物農(nóng)藥生產(chǎn)企業(yè)只有4 5家 這樣的產(chǎn)業(yè)布局 造成了產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定 商品劑型化程度低 在與國(guó)外產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)中 缺乏競(jìng)爭(zhēng)力 而國(guó)際上農(nóng)藥業(yè)主要由7家大公司控制 其銷(xiāo)售量占全球農(nóng)藥銷(xiāo)量的90 3 生物農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)在我國(guó)沒(méi)有得到足夠的重視 世界上主要發(fā)達(dá)國(guó)家政府均已陸續(xù)公布了禁用或限用化學(xué)農(nóng)藥名單 并制定規(guī)劃發(fā)展生物農(nóng)藥 目前 每年新研制成功和登記注冊(cè)的生物農(nóng)藥品種以4 的速度遞增 到2015年生物農(nóng)藥占所有農(nóng)藥的份額將由現(xiàn)在的2 3 增加到50 我國(guó)雖然在 中國(guó)21世紀(jì)議程 中提出發(fā)展生物農(nóng)藥 農(nóng)業(yè)部成立了綠色食品發(fā)展中心 國(guó)家環(huán)?？偩殖闪⒘擞袡C(jī)農(nóng)業(yè)食品發(fā)展中心 一些省市也已公布了在蔬菜瓜果上禁用的劇毒品 高毒化學(xué)農(nóng)藥名單 但迄今沒(méi)有國(guó)家統(tǒng)一的有關(guān)禁用限用劇毒 高毒 高殘留化學(xué)農(nóng)藥的法規(guī) 也沒(méi)有一個(gè)倡導(dǎo)和支持大力發(fā)展生物農(nóng)藥的中長(zhǎng)期發(fā)展規(guī)劃 4 由于新藥篩選成功率愈來(lái)愈低 對(duì)新藥性能的要求愈來(lái)愈高 因此新藥篩選越來(lái)越困難 篩選化學(xué)農(nóng)藥的機(jī)率只有二萬(wàn)分之一 而生物農(nóng)藥的成功率是五千分之一 與生物農(nóng)藥相比 化學(xué)農(nóng)藥的開(kāi)發(fā)周期3倍于生物農(nóng)藥 開(kāi)發(fā)費(fèi)用40倍于生物農(nóng)藥 注冊(cè)費(fèi)則是生物農(nóng)藥的100倍 這種狀況迫使企業(yè)尋求新的發(fā)展途徑 用更多的投入來(lái)開(kāi)發(fā)生物農(nóng)藥 隨著全民健康意識(shí)和環(huán)保意識(shí)的提高 生物農(nóng)藥的推廣必將成為今后農(nóng)藥發(fā)展的主流趨勢(shì) 目前 瑞士先正達(dá) 德國(guó)巴斯夫 日本武田制藥 美國(guó)孟山都等跨國(guó)公司已經(jīng)進(jìn)入中國(guó)生物農(nóng)藥市場(chǎng) 加入世界貿(mào)易組織后 我們所面對(duì)的不僅是國(guó)內(nèi)市場(chǎng) 而且是國(guó)際大市場(chǎng) 市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)將更加激烈 因此 為適應(yīng)國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境 生物農(nóng)藥必須 有所作為 微生物農(nóng)藥 由微生物體產(chǎn)生的具有防治病蟲(chóng)害和除雜草等功能的代謝產(chǎn)物或活菌體 范圍 微生物殺蟲(chóng)劑 微生物殺菌劑 農(nóng)用抗生素 微生物除草劑 微生物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑生物防治 用生物農(nóng)藥來(lái)對(duì)病蟲(chóng)害和雜草進(jìn)行防治優(yōu)點(diǎn) 不污染環(huán)境 有效控制病蟲(chóng)害 雜草 保持生態(tài)平衡 我國(guó)微生物農(nóng)藥主要以井崗霉素和bt為主 從品種 劑型 質(zhì)量和數(shù)量上與發(fā)達(dá)國(guó)家相差甚遠(yuǎn) 還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)的需求 在2001年國(guó)家計(jì)委高技術(shù)產(chǎn)業(yè)化示范工程項(xiàng)目中 天然植物源殺蟲(chóng)劑菊酯 年產(chǎn)6000噸 武大綠洲 系列生物病毒殺蟲(chóng)劑 真菌生防制劑 復(fù)合微生物活菌制劑和年產(chǎn)5000噸的寡聚糖生物農(nóng)藥5個(gè)生物農(nóng)藥項(xiàng)目獲得批準(zhǔn) 2002年又批準(zhǔn)年產(chǎn)3000噸 安徽奧綠 系列生物病毒殺蟲(chóng)劑 年產(chǎn)1萬(wàn)噸寧南霉素 線(xiàn)蟲(chóng)生防制劑和年產(chǎn)3萬(wàn)噸固體發(fā)酵bt等生物農(nóng)藥項(xiàng)目 一 微生物殺蟲(chóng)劑控制害蟲(chóng)更為安全 有效的方法微生物殺蟲(chóng)劑的優(yōu)點(diǎn) 特異性高 不傷害天敵 無(wú)毒可進(jìn)行生物降解昆蟲(chóng)對(duì)它的抗性產(chǎn)生較慢微生物殺蟲(chóng)劑的不足 殺蟲(chóng)效果較差 目前已經(jīng)在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的昆蟲(chóng)病原微生物包括真菌 細(xì)菌和病毒 一 細(xì)菌殺蟲(chóng)劑 在已知的病原細(xì)菌中 作為微生物殺蟲(chóng)劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用的是蘇云金桿菌 bacilusthuringiensis bt生物殺蟲(chóng)劑 和日本金龜子芽孢桿菌 因細(xì)菌致病的害蟲(chóng) 蟲(chóng)體發(fā)軟變色 有臭味 日本金龜子芽孢桿菌則用于防治金龜子幼蟲(chóng) 1 bt生物殺蟲(chóng)劑 1 發(fā)展及應(yīng)用 1902年發(fā)現(xiàn) 1951年發(fā)現(xiàn)商業(yè)價(jià)值 20世紀(jì)80年代 世界上bt生物殺蟲(chóng)劑總產(chǎn)量?jī)H8000噸 美國(guó)占1000噸 我國(guó)生物農(nóng)藥研究開(kāi)發(fā)起步較晚 但隨著國(guó)家對(duì)bt生物殺蟲(chóng)劑等研究開(kāi)發(fā)和推廣的日益重視 六五 至 十一五 國(guó)家科技攻關(guān)設(shè)專(zhuān)題研究 bt生物殺蟲(chóng)劑的品種 發(fā)酵水平有很大提高 并相繼推廣 bt生物殺蟲(chóng)劑可大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn) 產(chǎn)量達(dá)2 3萬(wàn)噸 年 并在20多個(gè)省市推廣用于防治糧 棉 果 蔬 林等多種害蟲(chóng) 寄生于130多種鱗翅目 膜翅目 雙翅目 直翅目和鞘翅目幼蟲(chóng)體內(nèi) 控制毛蟲(chóng) 毒蛾 白菜金翅夜蛾 煙草天蛾等 注 對(duì)家蠶有致病作用 可用0 3 的漂白粉消毒3分鐘即可解除毒性 2 生理生化特性 蘇云金桿菌 g 短桿菌 形成芽孢 周身鞭毛或無(wú)鞭毛 伴孢晶體 典型為菱形 也有圓形 方形 橢圓形 不規(guī)則形 bt對(duì)營(yíng)養(yǎng)條件要求不高 所需主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)屬動(dòng)植物蛋白質(zhì)衍生物 能在多種n源 碳源和無(wú)機(jī)鹽中正常發(fā)育 通常所利用的營(yíng)養(yǎng)是 碳源 淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖 直接為bt吸收利用n源 牛肉膏 蛋白胨 酵母粉 花生餅粉 豆餅粉 魚(yú)粉 玉米漿等 無(wú)機(jī)鹽 k2hpo4 mgso4 caco3 主要元素有磷 硫 鎂 鉀 鈉 鈣6種 微量元素的錳 鋅 硅 鐵等 微量元素所需甚微 水雜質(zhì)即可滿(mǎn)足 多了有毒 溫度 10 40 都能生長(zhǎng) 以28 32 較適 35 40 生長(zhǎng)很快 但易衰老 溫度低則生長(zhǎng)緩慢 因此在一定范圍內(nèi)提高t會(huì)縮短生長(zhǎng)期 但菌數(shù)量會(huì)降低 而t低則生長(zhǎng)慢 生長(zhǎng)期延長(zhǎng) 菌數(shù)相對(duì)來(lái)說(shuō)則增高 ph 與其他細(xì)菌類(lèi)似 該菌適于微堿性條件 最適ph是7 5 當(dāng)ph達(dá) 8 5時(shí)還能形成芽孢 如ph降至5以下則不能形成芽孢 氧 是一種好氧細(xì)菌 需要充足的空氣才能生長(zhǎng)發(fā)育良好 尤其當(dāng)芽孢形成時(shí) 若缺乏足夠的空氣時(shí)會(huì)延遲芽孢的形成或不能形成 它還影響到生長(zhǎng)速度 菌數(shù)和晶體 在深層培養(yǎng)時(shí)通氣不良會(huì)造成細(xì)菌溶解 使菌數(shù)降低 紫外線(xiàn) 陽(yáng)光對(duì)芽孢都有致死作用 芽孢暴露在紫外光下很快失活 1 分鐘失活12 2分鐘50 失活 10分鐘99 失活 在自然陽(yáng)光下 30分鐘50 失活 60分鐘80 失活 在290 400nm處死率最高 抗生素及化學(xué)物 放線(xiàn)菌素d 氯霉素 紅霉素及一些化學(xué)物質(zhì)都有影響 乳化劑對(duì)芽孢萌發(fā)有抑制作用 tritonx 100在100 g ml時(shí) 全部抑制了芽孢萌發(fā) 蘇蕓金桿菌的營(yíng)養(yǎng)體 蘇蕓金桿菌的孢子囊 bt致鱗翅目幼蟲(chóng)死亡癥狀 3 致病機(jī)理主要靠芽孢和毒素芽孢在腸道中萌發(fā) 大量增殖 穿透腸壁進(jìn)入血液 引起昆蟲(chóng)敗血癥毒素 主要是晶體毒素和 毒素晶體毒素是所有bt共有的毒素 存在于伴孢晶體中 在腸內(nèi)晶體毒素水解為毒性的短肽 穿過(guò)腸壁 形成敗血癥 毒素是胞外毒素 水溶性 熱穩(wěn)定性好 是rna聚合酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑 伴胞晶體 1 日本金龜子芽孢桿菌形態(tài) 2 日本金龜子芽孢桿菌 2 日本金龜子芽孢桿菌致病癥狀 3 bt殺蟲(chóng)劑的特點(diǎn) 1 高效 對(duì)人畜無(wú)毒 不污染環(huán)境 2 不殺傷害蟲(chóng)天敵 保持生態(tài)平衡 3 對(duì)植物無(wú)毒害 不影響作物的色 香 味 4 抗性產(chǎn)生緩慢 缺點(diǎn) 選擇性強(qiáng) 殺蟲(chóng)譜窄 殺蟲(chóng)速度慢 受氣溫影響 對(duì)蠶有毒 不受專(zhuān)利保護(hù) 4 蘇云金芽孢桿菌的生產(chǎn) 見(jiàn)書(shū)181頁(yè) 5 蘇云金芽孢桿菌的檢測(cè)5 1菌體含量測(cè)定使用分光光度計(jì)在278或680nm處測(cè)菌體濃度 lc50 引起群體一半死亡的殺蟲(chóng)劑濃度 5 2生物效價(jià)測(cè)定 1 取7個(gè)帶玻璃珠的錐形瓶 分別做上如下標(biāo)記 1 2 7 往1 瓶中加入200ml自來(lái)水和600mg標(biāo)準(zhǔn)品 混勻備用 分別往2 7 瓶中加200ml自來(lái)水和600mg32000iu mg 1效價(jià)的bt原粉 再分別往2 7 瓶中加100 l的助劑 即bcm 101 jfc 6501 b 10250 sd 1227a 將錐形瓶放置在搖床上搖30min 將下?lián)u床的錐形瓶藥液按1 5倍稀釋成5個(gè)濃度 每個(gè)濃度分別用60ml稀釋液浸葉片 2 取大小一致的小白菜葉片 經(jīng)自來(lái)水浸泡 沖洗 并自然晾干 分別浸入不同濃度的藥液中 浸10s后取出 立即用濾紙吸干葉片上多余的藥液 并放在搪瓷盤(pán)中自然晾干 最后將其置于小燒杯中 每個(gè)燒杯放入2片葉子 3 挑取出2齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)放置于小燒杯中 燒杯內(nèi)放一小團(tuán)浸過(guò)自來(lái)水的棉花球 每處理試蟲(chóng)10頭 用雙層紗布捆綁好 在室溫 相對(duì)濕度60 80 的條件下飼養(yǎng) 4 24 48h檢查死亡蟲(chóng)口數(shù) 計(jì)算死亡率 重復(fù)4次 5 進(jìn)行死亡率 lc50及效價(jià)的統(tǒng)計(jì) 測(cè)試品效價(jià) 標(biāo)準(zhǔn)品lc50 測(cè)試品lc50 標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià) 5 3伴孢晶體含量測(cè)定取發(fā)酵液樣品加入1 溶菌酶 30 恒溫下充分研磨至鏡檢60 70 菌體細(xì)胞壁破碎 再用超聲波處理30s打碎細(xì)胞 參照l(shuí)aemmli 1951 方法進(jìn)行sds page凝膠電泳 濃縮膠濃度為4 分離膠濃度為10 加10 sds 電泳后的聚丙烯酰胺凝膠經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色后再脫色處理 運(yùn)用imagemasterid軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析 5 4濕潤(rùn)性檢測(cè)取7個(gè)250ml的燒杯 做上標(biāo)記 每個(gè)燒杯裝入100ml自來(lái)水 用托盤(pán)天平分別稱(chēng)取每種混粉5 0g 以5 0gbt原粉作為對(duì)照 將混粉倒入燒杯中 測(cè)出原粉完全沉入水中所需的時(shí)間 時(shí)間越少 濕潤(rùn)性越大 并記錄檢測(cè)時(shí)間 5 5ph值測(cè)定取7個(gè)100ml的燒杯 做上標(biāo)記 將每個(gè)燒杯裝入大約50ml的蒸餾水 用托盤(pán)天平分別稱(chēng)取每種混粉1 0g 以1 0gbt原粉為對(duì)照 將稱(chēng)好的樣品倒入相應(yīng)的燒杯 用玻璃棒攪拌均勻 將燒杯加滿(mǎn)蒸餾水 攪拌均勻 靜置10min 用電子酸度計(jì)測(cè)出其ph值 5 5水分檢測(cè)取7個(gè)稱(chēng)量瓶 做上記號(hào) 放入恒溫烘干箱中使水分烘干 將烘干的稱(chēng)量瓶放在電子天平上稱(chēng)出瓶重 w1 再分別裝入混粉和對(duì)照bt原粉 樣品質(zhì)量為1 0 2 0g 稱(chēng)出樣品重量與稱(chēng)量瓶重之和 w2 將裝好的稱(chēng)量瓶放入電子恒溫箱中烘干 烘干溫度為 105 2 烘干時(shí)間為2h 烘干結(jié)束后 再用電子天平稱(chēng)出瓶重與干燥后樣品重量之和 w3 則濕重 w2 w3 水分含量 w2 w3 w2 w1 5 6蘇云金芽孢桿菌藥效測(cè)定方法 藥效測(cè)定是確定藥劑的殺蟲(chóng)或殺菌效力的一種方法 也是評(píng)定某種藥劑使用價(jià)值的依據(jù) 因此 藥效測(cè)定可以作為篩選農(nóng)藥新品種和擴(kuò)大老品種應(yīng)用范圍的一個(gè)重要步驟 藥效測(cè)定的一般原理 是用藥劑處理害蟲(chóng)或病菌 然后觀察它們的反應(yīng) 根據(jù)藥劑對(duì)害蟲(chóng)或病菌的不同程度的毒害 從而看出藥劑毒力的大小 ppm是百萬(wàn)分濃度符號(hào) 因它不是法定計(jì)量單位 國(guó)際上也不通用 如遇有以ppm表示的濃度 改為質(zhì)量百萬(wàn)分濃度單位mg kg 毫克 千克 或質(zhì)量 體積百萬(wàn)分濃度單位mg l 毫克 升 5 6 1室內(nèi)毒力測(cè)定 為了使測(cè)定結(jié)果可靠 應(yīng)注意下述幾點(diǎn) 供試病 蟲(chóng)的種類(lèi) 生理階段及健康狀況等 要求相同 每次試驗(yàn)的條件 溫度 濕度 施藥方法和用藥量等 力求一致 應(yīng)設(shè)l 2個(gè)對(duì)照 一是空白對(duì)照 即不施藥 二是用當(dāng)?shù)爻Ｓ枚倚Ч€(wěn)定的農(nóng)藥以其相應(yīng)濃度作比較 試驗(yàn)應(yīng)重復(fù)3 5次 施藥工具最好專(zhuān)用 或每處理完一種農(nóng)藥 或同種農(nóng)藥的不同濃度 應(yīng)洗凈后再用 藥效測(cè)定 1 供試害蟲(chóng)的準(zhǔn)備 供室內(nèi)測(cè)定的害蟲(chóng) 可從田間采集 應(yīng)在同一塊田內(nèi)采集 而且要隨采隨用 并要盡量避免害蟲(chóng)受傷 影響試驗(yàn)效果 還應(yīng)選擇同一齡期 鱗翅目幼蟲(chóng)以3齡前的幼蟲(chóng)為好 體型大小和健康一致的害蟲(chóng)做試驗(yàn) 供試害蟲(chóng)的數(shù)量 體型大的 如菜青蟲(chóng) 每一處理不應(yīng)少于20頭 3次重復(fù)不少于60頭 體型小的 如蚜蟲(chóng) 葉蟬和稻飛虱 不應(yīng)少于50頭 體型中等的不應(yīng)少于30頭 2 施藥方法 撒粉法 用小型撒粉器將藥直接撒于蟲(chóng)體上 或撒于植物體表再放進(jìn)供試害蟲(chóng) 對(duì)體型小的蚜蟲(chóng)等 應(yīng)用干凈毛筆接蟲(chóng) 也可將藥粉同時(shí)撒在蟲(chóng)體和植物上 為了使蟲(chóng)體或植株容易沾藥 可在撒藥前先將植株或蟲(chóng)體噴上少量清水 噴霧法 用小型噴霧器向蟲(chóng)體或植株均勻噴灑藥液 至蟲(chóng)體或植株上開(kāi)始有過(guò)量藥液滴下為止 浸漬法 直接將蟲(chóng)體或附有害蟲(chóng)的植物體在藥液中浸漬后 立即取出 并使蟲(chóng)體或植株上過(guò)多的藥液流去 或用吸水紙吸去 使其與田間噴霧時(shí)的實(shí)際情況接近 然后放入養(yǎng)蟲(chóng)籠內(nèi)飼養(yǎng)觀察 3 農(nóng)藥持效期的測(cè)定方法 把一定濃度的藥液噴灑在盆栽的植物 即害蟲(chóng)的寄主 上 2天后 每隔24h接上一批供試害蟲(chóng) 每天觀察1次各處理的害蟲(chóng)死亡情況 或把藥劑噴灑在田間作物上 2天后 每隔24h采回有藥的葉片 分別飼養(yǎng)供試害蟲(chóng) 觀察其死亡率 并推算農(nóng)藥的持效期 4 藥效檢查 一般在用藥后24一72h內(nèi)檢查 體型較小的害蟲(chóng) 當(dāng)肉眼不能分辨其死活時(shí) 可用放大鏡觀察 并用毛筆或小鑷子撥動(dòng)蟲(chóng)體 確定其是否死亡 有些昆蟲(chóng)有假死性 檢查時(shí)應(yīng)特別注意 檢查后統(tǒng)計(jì)死亡百分率 死亡率 死蟲(chóng)數(shù) 供試總蟲(chóng)數(shù) 100 如果對(duì)照組 空白 中供試害蟲(chóng)死亡率 即自然死亡率 超過(guò)20 時(shí) 則全部試驗(yàn)應(yīng)重做 自然死亡率在5 一20 之間 則試驗(yàn)有效 死亡率需按下式校正 校正死亡率 對(duì)照組的活蟲(chóng)率 處理組的活蟲(chóng)率 對(duì)照組的活蟲(chóng)率 100 5 6 2大田藥效試驗(yàn) 田間藥效試驗(yàn)的條件接近于大田生產(chǎn) 試驗(yàn)結(jié)果可作為大田生產(chǎn)正確用藥的依據(jù) 為了提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性 現(xiàn)就大田試驗(yàn)的一般方法及注意事項(xiàng)作簡(jiǎn)要說(shuō)明 1 試驗(yàn)方法 1 實(shí)驗(yàn)地的選擇 應(yīng)選地力和作物長(zhǎng)勢(shì)基本一致 排灌方便 病 蟲(chóng)為害嚴(yán)重 分布較均勻等有代表性的田塊作實(shí)驗(yàn)地 2 試驗(yàn)區(qū)的設(shè)置 在做大田試驗(yàn)前 應(yīng)先進(jìn)行小區(qū)試驗(yàn) 小區(qū)面積一般為30 10m2 然后將小區(qū)試驗(yàn)中藥效好的品種 做大區(qū)試驗(yàn) 每一大區(qū)的面積不少于300m2 小區(qū)和大區(qū)實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)2 3個(gè)重復(fù) 在大區(qū)試驗(yàn)中藥效突出的 則進(jìn)一步進(jìn)行大面積示范試驗(yàn) 大田試驗(yàn)除了設(shè)施藥區(qū)外 還應(yīng)設(shè)不施藥區(qū) 即空白對(duì)照 及當(dāng)?shù)爻Ｓ脙?yōu)良農(nóng)藥及其常用濃度的對(duì)照區(qū) 混合土農(nóng)藥 則應(yīng)選擇同品種 同用量的化學(xué)農(nóng)藥作對(duì)照 3 施藥方法及用量 供試的藥劑 應(yīng)配制成 定的劑型和濃度 一般每公頃噴霧900 1050l 噴粉22 5 30kg 撒毒土225 375kg 施藥要細(xì)致均勻 隨配隨用 施藥后如遇雨 一般要求補(bǔ)施 4 做好試驗(yàn)基本情況的記載 一般記載的項(xiàng)目有 試驗(yàn)地點(diǎn) 防治對(duì)象 作物名稱(chēng)及生育期 試驗(yàn)面積 試驗(yàn)藥劑的種類(lèi) 配方 濃度 單位面積用藥量 施藥方法及施藥時(shí)間 藥效調(diào)查 調(diào)查日期 調(diào)查方法 藥效及藥效持續(xù)天數(shù) 有無(wú)藥害表現(xiàn) 氣象要素變化情況 5 病蟲(chóng)調(diào)查取樣方式 農(nóng)作物病蟲(chóng)害的田間調(diào)查 通常采用隨機(jī)取樣 隨機(jī)取樣是田間各個(gè)取樣單位都有同等機(jī)會(huì)被抽取作為樣本 使抽取的樣本具有代表性 不能憑主觀隨意取樣 病蟲(chóng)害在田間的分布情況 因病蟲(chóng)害種類(lèi) 農(nóng)作物種類(lèi) 作物栽培方式及農(nóng)田環(huán)境條件不同而異 根據(jù)病蟲(chóng)害在田間分布情況 可以采用對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)取樣 棋盤(pán)式取樣 平行線(xiàn)取樣和 z 字形取樣等方式 害蟲(chóng)在田間的分布一般是隨機(jī) 均衡的 但也有非隨機(jī) 不均衡的 前者害蟲(chóng)發(fā)生普遍危害較重時(shí) 采用對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)取樣具有足夠的代表性 如果害蟲(chóng)發(fā)生不太普遍 危害不重時(shí) 可采取棋盤(pán)式取樣法 2 藥效檢查及計(jì)算方法舉例 1 稻螟 一般在螟卵盛孵期施藥 以調(diào)查枯心 包括枯鞘 和白穗 包括死孕穗 為主 對(duì)于二化螟的危害還應(yīng)檢查蟲(chóng)傷株 枯心率在最后一次施藥后10一15天或在始蛹期檢查 白穗率則在乳熟期后檢查 大田采取平行線(xiàn)跳躍式取樣 每個(gè)處理不少于200叢 記算螟密度 枯心率或白穗率 若小區(qū)中卵塊 蟲(chóng)口密度大可適當(dāng)調(diào)整 秧田每小區(qū)以對(duì)角線(xiàn)5點(diǎn)取樣 每點(diǎn)檢查0 1 0 2m2的枯心苗 按下式計(jì)算枯心率 或白穗率 及防治效果 枯心率 或白穗率 枯心 或白穗 總數(shù) 調(diào)查總數(shù) 100 防治效果 對(duì)照區(qū)枯心 或白穗 數(shù) 處理后枯心 或白穗 數(shù) 對(duì)照區(qū)枯心 或白穗 數(shù) 100 2 玉米螟 施藥后10天左右 檢查莖被蛀株數(shù) 一般每小區(qū)檢查20 60株 大區(qū)查100株 收獲時(shí) 解剖一定株數(shù) 檢查蟲(chóng)數(shù) 包括幼蟲(chóng) 蛹和蛹?xì)?防冶效果按下式計(jì)算 防治效果 對(duì)照區(qū)蟲(chóng)蛀數(shù) 處理區(qū)蟲(chóng)蛀數(shù) 對(duì)照區(qū)蟲(chóng)蛀數(shù) 100 6 注意事項(xiàng) 1 桑園禁用 2 在害蟲(chóng)低齡期施藥效果更佳 3 施藥最好在晴天傍晚或陰天全天用藥 清晨亦可 4 施藥遇雨要補(bǔ)施 噴粉則宜在有露水時(shí)進(jìn)行 5 不能與殺菌劑混用 6 蘇云金桿菌制劑應(yīng)密閉保存在干燥 低于25 的陰涼地方 防止曝曬和潮濕 以免變質(zhì)和失效 7 噴霧過(guò)程中要時(shí)時(shí)搖動(dòng)藥水箱 以免菌粉沉淀影響殺蟲(chóng)效果及堵塞噴嘴 8 施藥時(shí)期一般比化學(xué)農(nóng)藥提前3 4天 藥效一般能保持6 12天 施藥時(shí)期和次數(shù)要根據(jù)害蟲(chóng)活動(dòng)和作物生長(zhǎng)情況而定 一般在害蟲(chóng)的幼齡期進(jìn)行防治 死蟲(chóng)再利用 將bt致死及黑變的蟲(chóng)體收集起來(lái) 用紗布袋包好 在水中揉搓 每50克蟲(chóng)尸冼液對(duì)水50一100千克噴霧 二 真菌殺蟲(chóng)劑 全世界已知的致病真菌達(dá)530多種 已形成規(guī)模生產(chǎn)的是白僵菌 beauveriabassiana bals vull 和綠僵菌 metarrhiziumanisopliea metch sor 擬青霉 真菌致死害蟲(chóng)的尸體硬化 而呈白色 綠色等顏色 主要用于防治玉米螟 稻苞蟲(chóng) 地老虎 斜紋夜蛾 林業(yè)上主要用于防治松毛蟲(chóng)等害蟲(chóng) 已取得了顯著成效 但在蠶區(qū)不宜應(yīng)用 白僵菌的分布范圍很廣 從海拔幾米至2000米以上的高山均發(fā)現(xiàn)過(guò)白僵菌的存在 世界上已在200多種昆蟲(chóng)體上發(fā)現(xiàn)了白僵的感染寄生 利用白僵菌防治農(nóng)林害蟲(chóng)已擴(kuò)大到60多個(gè)蟲(chóng)種 目前在生產(chǎn)防治上 主要采取地面或飛機(jī)噴灑白僵菌制劑的方式進(jìn)行施藥 也可在兩季從林間采集森林葉部害蟲(chóng)活幼蟲(chóng)集中撒上白僵菌原菌粉 或配成含量為5億孢子 ml的菌液 采活蟲(chóng)在菌液中沾一下再放加樹(shù)上任其自由爬行 這些帶菌蟲(chóng)死后 長(zhǎng)出很多分生孢子 即形成許多白僵菌流行點(diǎn) 逐步促成林間害蟲(chóng)白僵菌流行 1 發(fā)展現(xiàn)狀 白僵菌對(duì)鞘翅目害蟲(chóng)有獨(dú)特的防治效果 由于其無(wú)殘毒 菌劑易生產(chǎn) 產(chǎn)品較耐儲(chǔ)藏 持效期長(zhǎng) 施用簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn) 日益引起研究者的注目 最早是法國(guó)用布氏白僵菌芽生孢子制劑成功地防治森林西方五月鰓金龜 其液體發(fā)酵產(chǎn)品曾經(jīng)達(dá)到半商品化的程度 現(xiàn)在 已有十幾個(gè)國(guó)家將布氏白僵菌用于田間防治試驗(yàn) 防治對(duì)象達(dá)十余種 并有一些大面積防治成功的實(shí)例 日本防治桑樹(shù) 無(wú)花果樹(shù)的黃星天牛 我國(guó)50年代開(kāi)始白僵菌的研究和應(yīng)用 應(yīng)用球孢白僵菌防治松毛蟲(chóng) 玉米螟是世界上殺蟲(chóng)真菌應(yīng)用面積最大 最為成功的事例之一 目前仍保持50萬(wàn)公頃 年 應(yīng)用面積最高年份達(dá)2000萬(wàn)畝 據(jù)1996年不完全統(tǒng)計(jì) 我國(guó)有白僵菌生產(chǎn)廠家多達(dá)64個(gè) 多年來(lái)國(guó)內(nèi)對(duì)優(yōu)良菌株選育 生產(chǎn)工藝 劑型和應(yīng)用技術(shù)等進(jìn)行了較為詳盡的研究 成功防治害蟲(chóng)40種以上 但國(guó)內(nèi)至今仍未有注冊(cè)的白僵菌產(chǎn)品 2 特點(diǎn) 1 無(wú)農(nóng)殘?jiān)谵r(nóng)產(chǎn)品頻頻因農(nóng)藥殘留超標(biāo)被拒之門(mén)外的今天 我們能自豪的宣稱(chēng) 即使施用白僵菌后立刻收獲產(chǎn)品也不會(huì)造成任何農(nóng)藥殘留 2 無(wú)抗性害蟲(chóng)對(duì)化學(xué)農(nóng)藥的抗性使得其殺蟲(chóng)效果逐年減退 白僵菌通過(guò)在自然條件下與害蟲(chóng)的體壁接觸感染致死 害蟲(chóng)不會(huì)對(duì)其產(chǎn)生任何抗性 連年使用 效果反而越來(lái)越高 3 再生長(zhǎng)性白僵菌新型生物農(nóng)藥含有活體真菌及孢子 施入田間后 借助適宜的溫度 濕度 更可以繼續(xù)繁殖生長(zhǎng) 增強(qiáng)殺蟲(chóng)效果 4 aa級(jí)安全白僵菌對(duì)人 畜均無(wú)口服毒性問(wèn)題 從此可斷絕使用傳統(tǒng)農(nóng)藥導(dǎo)致的田間中毒現(xiàn)象 5 高選擇性不同于化學(xué)農(nóng)藥不分?jǐn)澄业膶⒁嫦x(chóng) 害蟲(chóng)盡數(shù)毒殺 白僵菌能主動(dòng)回避對(duì)瓢蟲(chóng) 草蛉和食蚜虻等益蟲(chóng)的侵染攻擊 從而整體田間防治效果更好 3 生理生化性狀 白僵菌是一種半知菌類(lèi)的蟲(chóng)生真菌 具有營(yíng)養(yǎng)器官 菌絲 和繁殖器官 分生孢子 白僵菌屬 beauveriavuillemin 屬于絲孢綱 叢梗孢目 叢梗孢科 白僵菌屬 是一種廣譜性的昆蟲(chóng)病原真菌 對(duì)700多種有害昆蟲(chóng)都能寄生 致病性強(qiáng) 適應(yīng)性強(qiáng) 白僵菌菌株菌落粉狀 白色 后變?yōu)榈S色 產(chǎn)孢細(xì)胞單生 很少簇生 產(chǎn)孢軸纖細(xì) 膝狀彎曲 具小齒突 分生孢子透明 光滑 橢圓形 基部有時(shí)有小尖突 自然狀態(tài)下寄生在蟲(chóng)體生長(zhǎng)并穿出外骨骼 在蟲(chóng)體表面形成白色被覆物 產(chǎn)孢細(xì)胞濃密簇生 但有時(shí)輪生或單生 直接著生在氣生菌絲 稍有分化的分生孢子?；蚺虼蟮谋?xì)胞上 瓶狀 下部膨大 上部延長(zhǎng)呈頸狀 在頂生的分生孢子下方不遠(yuǎn)處再分枝產(chǎn)孢 反復(fù)向頂部合軸式產(chǎn)孢 形成具小齒突的產(chǎn)孢軸 白僵菌菌絲 卵孢白僵菌的分生孢子 4 圖片 白僵菌分生孢子梗及分生孢子 白僵菌侵染昆蟲(chóng)的死亡癥狀成蟲(chóng)及蛹 硬化病 白僵菌侵染昆蟲(chóng)幼蟲(chóng) 花生和大豆田中健株與受害株的比較 5 致病機(jī)理 通過(guò)人工撒施 使白僵菌分生抱子接觸到寄主害蟲(chóng)的表皮或氣孔 或在葉片上被害蟲(chóng)吃入消化道 遇適宜條件則萌發(fā)生出芽管 侵入蟲(chóng)體并生長(zhǎng)繁殖 消耗寄主害蟲(chóng)體內(nèi)養(yǎng)分 形成大量菌絲和孢子 布滿(mǎn)蟲(chóng)體全身 并產(chǎn)生白僵菌素 卵孢白僵菌素 草酸鈣等 導(dǎo)致害蟲(chóng)緩慢死亡 已死亡的害蟲(chóng)因身上長(zhǎng)滿(mǎn)白僵菌的菌絲和分生孢子 借助接觸或氣流又傳播到其他健康蟲(chóng)體上引起感染 形成 瘟疫 而導(dǎo)致死亡 落入土壤中的自僵菌還能在土壤中過(guò)冬 在第2年害蟲(chóng)發(fā)生期 通過(guò)氣流的傳播再傳染害蟲(chóng) 并導(dǎo)致死亡 表現(xiàn)為一次施藥 多年有效的效果 故為良好的 以菌冶蟲(chóng) 的生物防冶制劑 6 白僵菌的生產(chǎn) 1 斜面菌種培養(yǎng) pda培養(yǎng)基或小米飯培養(yǎng)基 25 28 培養(yǎng) 孢子成熟即可 2 種子培養(yǎng) 豆餅粉培養(yǎng)基或淘米水培養(yǎng)基 液體培養(yǎng)70h 產(chǎn)大量節(jié)孢子 3 固體擴(kuò)大培養(yǎng) 前三天 低溫高濕 長(zhǎng)菌絲 后期 高溫低濕 長(zhǎng)孢子 7 產(chǎn)品的處理與檢測(cè) 1 產(chǎn)品干燥 一般采用的干燥方法是曬干 曬時(shí)應(yīng)用布 紙或塑料布蓋在上面 避免陽(yáng)光直曬 或放在35 一40 的烘房?jī)?nèi)進(jìn)行烘干 一般烘干程度用手摸菌劑無(wú)濕潤(rùn)感覺(jué)即可 作為長(zhǎng)期貯藏的含水最不超過(guò)10 2 產(chǎn)品質(zhì)量檢查 用手觸動(dòng)干燥產(chǎn)品時(shí) 白色粉霧飛揚(yáng) 粉霧越濃 質(zhì)量越好 白僵菌的產(chǎn)品質(zhì)量 主要取決于孢子數(shù)量的多少和孢子發(fā)芽率 要求每克成品含活孢子數(shù)50億一100億個(gè)之間 3 孢子發(fā)芽試驗(yàn)方法 用0 1 蔗糖溶液配成白僵菌孢子懸浮液滴在載玻片上 放在內(nèi)有吸水紙的培養(yǎng)皿內(nèi)保溫培養(yǎng) 溫度保恃在24 左右 亦可用水瓊脂平板上涂上孢子液進(jìn)行培養(yǎng) 然后用顯微鏡檢查孢子發(fā)芽數(shù) 一般經(jīng)72小時(shí)培養(yǎng) 孢子發(fā)芽率在90 以上者為合格 4 害蟲(chóng)體內(nèi)白僵菌菌體數(shù)量的測(cè)定隨機(jī)選取試驗(yàn)中各處理 之前進(jìn)行毒力實(shí)驗(yàn) 的蚜尸3頭 分別裝入1 5ml離心管 加入50 l滅菌的0 05 v v tween 80 用玻璃棒充分勻漿 然后取勻漿液稀釋成不同濃度 吸取100 l涂布接種于含有500 g ml頭孢霉素的czm平板上培養(yǎng) 3d后統(tǒng)計(jì)菌落形成單位 cfu colony forming unit 換算成每頭蟲(chóng)體內(nèi)所含孢子或菌絲段數(shù) 每處理重復(fù)3次 僵蠶的生產(chǎn) 僵蠶 又稱(chēng)白僵蠶 僵蟲(chóng)等 乃家蠶幼蟲(chóng)感染白僵菌后致死的干燥蟲(chóng)體 是一種傳統(tǒng)中藥材 具有祛風(fēng)熱 化痰 散結(jié) 通經(jīng)止痛的功效 可用于治療中風(fēng) 齒痛等疾病 白僵菌的培養(yǎng)方法有兩種 一種是通過(guò)培養(yǎng)基培殖菌種 這里不作介紹 另一種是將得病或保存的僵蠶4 10條 浸泡在2斤無(wú)菌水中一段時(shí)間即制得菌懸浮液 每匾蠶用噴霧器噴4兩懸浮液 噴液以蠶體著霧三分之二為宜 噴得過(guò)多 病蠶會(huì)早死 過(guò)少 蠶不會(huì)死 這是生產(chǎn)技術(shù)的關(guān)鍵 接菌時(shí) 蠶室應(yīng)保持溫度26 28 濕度在90 以上 不宜通風(fēng) 接菌后待蠶體上的菌液干燥后再喂桑葉 注 調(diào)制的懸浮液必須在6小時(shí)用完 否則會(huì)失效 接菌后的蠶在1天以后慢慢表現(xiàn)為食欲不振 3 4天后開(kāi)始發(fā)病 并開(kāi)始出現(xiàn)病斑 死亡 接菌后5 6天死蠶較多 7 8天全部死亡 在后期發(fā)生僵死時(shí)要注意翻動(dòng) 以免發(fā)生蠶蠶 蠶匾粘結(jié)現(xiàn)象 一般翻動(dòng)三次 第一次 在尸體發(fā)硬后 第二次在有菌絲出現(xiàn)時(shí) 第三次在菌絲長(zhǎng)好后 待菌絲長(zhǎng)足 用手摸死蠶有白色粉末粘在手指上時(shí) 厀用來(lái)加工 加工可用溫火供干 不宜用太陽(yáng)曬干 或倒入石灰拌勻 吸去水分后 晾干即可貯存 用作菌種的應(yīng)陰干 8 注意事項(xiàng) 1 白僵菌對(duì)高溫比較敏感 在20 28 使用為宜 遇到高溫會(huì)自然死亡 所以菌液配好后要于2h內(nèi)用完 以防孢子萌發(fā)或死亡而失去侵染害蟲(chóng)的能力 2 白僵菌用后 一般害蟲(chóng)4 5天死亡 所以應(yīng)提前2 3天使用 3 不能與化學(xué)殺菌劑混用 但與殺蟲(chóng)劑混用后 效果更好 4 在養(yǎng)蠶區(qū)施用 要注意做到遠(yuǎn)距離的空間隔離 在放養(yǎng)柞蠶的山區(qū) 不宜在附近林區(qū)施用白僵菌防治松毛蟲(chóng) 5 白僵菌會(huì)使部分人皮膚過(guò)敏 如低燒 皮膚刺癢等 應(yīng)帶上口罩 手套 脖子上系毛巾等 6 本劑應(yīng)貯存在陰涼 干燥處 三 病毒 已發(fā)現(xiàn)的昆蟲(chóng)病原病毒主要是核多角體病毒 npv 其次為顆粒體病毒 gv 因病毒致死的蟲(chóng)體變軟 組織液化 體壁破裂后流出白色或褐色的粘液 無(wú)臭味 幼蟲(chóng)病死后 往往臀足緊附在植株上 體軀下吊 前胸膨大 病毒病幼蟲(chóng)倒掛于枝干上體色變淡