流式細胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用.doc

流式細胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用摘要：隨著現(xiàn)代激光技術(shù)、電子檢測技術(shù)和電子計算機技術(shù)等的迅速發(fā)展，流式細胞儀(FCM)在免疫學(xué)、生物學(xué)、遺傳學(xué)、血液學(xué)、臨床檢驗等領(lǐng)域中得到了更加廣泛的應(yīng)用。在免疫學(xué)研究領(lǐng)域，F(xiàn)CM以快速、靈活及定量等特點被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究和臨床治療的各個方面，尤其是與單克隆抗體技術(shù)的結(jié)合，使其在免疫分型、分選、免疫監(jiān)測、免疫細胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面發(fā)揮了重要的作用，成為現(xiàn)代免疫學(xué)研究不可缺少的工具。該文對近年來流式細胞儀在免疫學(xué)研究中的應(yīng)用進展進行了綜述。關(guān)鍵詞：流式細胞儀；免疫學(xué)；檢測流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、計算機技術(shù)、細胞熒光化學(xué)技術(shù)以及單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器1。FCM 可對細胞大小、細胞表面抗原的表達等進行快速、靈活、定量、多參數(shù)的檢測，而且，可同時用于檢測細胞內(nèi)的核酸定量、DNA倍體、細胞周期分析， 細胞因子和黏附分子等2。具有分析速度快、精確度高、重復(fù)性好和費用低廉等優(yōu)點。1流式細胞儀介紹1.1流式細胞儀的工作原理流式細胞儀主要由流動室和液流系統(tǒng)，激光源和光學(xué)系統(tǒng)，光電管和檢測系統(tǒng)，計算機分析系統(tǒng)和細胞分選系統(tǒng)5部分組成，其中，流動室是儀器的核心部件。將待測標本制備成單細胞懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色后，由氣壓裝置送入流動室，以一定的流速經(jīng)過噴嘴進入激光聚焦區(qū)，流速的選擇與檢測的目的有關(guān)，此時，在激光束的照射下，被熒光染色的細胞產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光，其散射光信號和熒光信號經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)收集，由檢測系統(tǒng)轉(zhuǎn)換成為電信號，再通過模/數(shù)轉(zhuǎn)換器，轉(zhuǎn)換為可被計算機識別的數(shù)字信號，各種信號經(jīng)計算機采集后，用相應(yīng)的應(yīng)用軟件進行分析處理，最后，以直方圖或三維圖的形式顯示出來。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，可同時測定一個細胞上的多種不同的特征參數(shù)，從而可以對細胞進行分類3。1.2流式細胞儀機型介紹近年，流式細胞儀的主要生產(chǎn)廠家有美國的BD (BectonDickinson)公司、貝克曼庫耳(Beckman Coulter)公司和德國的Partec公司。國內(nèi)使用的流式細胞儀主要由前兩家生產(chǎn)。它們生產(chǎn)出一系列科研型和臨床型的流式細胞儀，并研制生產(chǎn)了流式細胞儀所用的各種單克隆抗體和熒光試劑。流式細胞儀可分為兩大類，一類為臨床分析型(又稱小型機、臺式機)，其特點為儀器光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定，自動化程度高，易學(xué)易掌握，適合在臨床實驗室中應(yīng)用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的MOFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。另一類為科研分選型(又稱綜合型)，特點為功能齊全，分析靈活，可快速將所感興趣的細胞分選出來，同時可選配多種波長類型的激光器，適用于廣泛的科學(xué)研究之用。如BD公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cytomation公司的MOFLOMLS等。隨著計算機技術(shù)、電子制造技術(shù)、激光技術(shù)及熒光素合成技術(shù)的發(fā)展，流式細胞儀的制造工藝、功能、精確度等有了質(zhì)的飛躍。流式細胞儀已開始向模塊化發(fā)展，即它的光學(xué)系統(tǒng)、檢測器單元和電子系統(tǒng)都可以按照試驗要求隨意更換4。各流式細胞儀生產(chǎn)廠商繼續(xù)推出新產(chǎn)品以滿足用戶的不同需要。如BD公司的FACSAria (高速細胞分選儀) 、分選增強型FACSVantage SETM (多色分析和高速分選流式細胞儀)、LSR II(數(shù)字化分析型流式細胞儀)，F(xiàn)ACSCanto(雙激光六色分析流式細胞儀)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomics FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用單激光或雙激光激發(fā)方式，可進行五色分析。Partec公司的頂級科研型十三色熒光流式細胞儀CYFLOW ML，臨床科研型六色熒光流式細胞儀DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流動成像細胞儀)，將流式多色檢測技術(shù)和熒光顯微圖像顯示技術(shù)結(jié)合在一個平臺上，不僅可以通過熒光信號的強度，還可以通過細胞熒光圖像對細胞內(nèi)外信號定位，從而對細胞亞群進行定性和定量分析。2流式細胞儀在免疫學(xué)中的應(yīng)用近年來，隨著生物醫(yī)學(xué)等相關(guān)學(xué)科的發(fā)展和免疫學(xué)研究的深入，流式細胞儀在分子免疫學(xué)、免疫生物學(xué)和免疫遺傳學(xué)，免疫血液學(xué)、免疫藥理學(xué)、移植免疫學(xué)、腫瘤免疫學(xué)、抗感染免疫學(xué)、臨床免疫學(xué)等免疫學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)學(xué)科，以及淋巴細胞及其亞群分析、淋巴細胞免疫分型、細胞因子檢測等臨床研究中，也有了越來越廣泛的應(yīng)用。2.1淋巴細胞及其亞群分析FCM在臨床淋巴細胞及其亞群分析中得到廣泛應(yīng)用，可同時檢測出一種或幾種淋巴細胞細胞表面抗原，將不同的淋巴細胞亞群區(qū)分開，并計算出它們相互間的比例。通過淋巴細胞及其亞群數(shù)量的檢測，可了解在不同情況下機體的免疫功能狀態(tài)，輔助臨床疾病的診斷，探索疾病的發(fā)病機理、病程、預(yù)后，指導(dǎo)臨床治療方案5。由于FCM可以進行高靈敏度、高速度和多參數(shù)分析，使FCM對血液淋巴細胞亞群的檢測較其他方法更精確，故其被認為是血液淋巴細胞亞群分析的標準方法6。2.1.1檢測項目在臨床上，淋巴細胞及其亞群分析項目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；絕對計數(shù)(TruCount)；活化淋巴細胞的檢測(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4 Th/i和CD8Ts/c的進一步區(qū)分；Naive/Memory T細胞亞群的檢測；Th1/Th2亞群的檢測。用流式細胞儀診斷某種疾病時，經(jīng)常需要檢測多個項目，如當人類感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要選擇地侵入人類具有重要免疫功能的T淋巴細胞亞群中的輔助性T細胞，即Th細胞(CD4)，使具有重要免疫功能的T細胞群被破壞，繼而累及全身免疫器官，使機體免疫功能下降。檢測的免疫指標表現(xiàn)為：T淋巴細胞總數(shù)減少(正常值的65%81%)；T細胞亞群比值倒置，即Th/Ts1.0(正常1.3122.11)；Th細胞(CD4)絕對計數(shù)200個/L(正常值4001 500細胞/L)，CD8 T細胞在感染早期增多，后期則下降；Ts細胞增高，NK細胞減少或活力下降，B淋巴細胞群則在正常范圍；CD4/CD8 明顯低于健康成人(P0.01)。2.1.2檢測技術(shù)的發(fā)展隨著新的熒光色素分子的不斷發(fā)現(xiàn)，熒光標記技術(shù)的進步和流式細胞儀的多激光激發(fā)技術(shù)的進展，多色熒光分析得到迅速發(fā)展，三色、四色甚至五色或六色熒光分析對細胞亞群的識別、細胞功能評價等更為精確。近年，淋巴細胞及其亞群的分析已經(jīng)發(fā)展到三色熒光以上分析，且借用MultiSET全自動獲取分析軟件完成。如：通過四色熒光標記，對外周血T淋巴細胞亞群可進行快速、客觀、準確檢測及絕對計數(shù)分析78。利用流式細胞儀，采用多色熒光標記的單克隆抗體，分析黏附性T 細胞表面CD3 CD4 或CD8CD19CD16CD45ROCD62CD27 CD57 抗原，從而對LFA1adhesive T 細胞快速準確地測定9?？傊昧魇郊毎麅x檢測淋巴細胞及其亞群的檢測技術(shù)朝著多激光、多色分析方向發(fā)展。近年來，為了使樣本一次檢測，得到更多結(jié)果，滿足臨床多色分析診斷的需要，一些廠家為臨床應(yīng)用專門設(shè)計了六色分析流式細胞儀。2.2白血病免疫分型白血病是白細胞在分化到某個階段受阻后呈克隆性異常增殖的結(jié)果，它的發(fā)病是多階段的，不同病因引起的白血病的發(fā)病機制不同，在治療和預(yù)防上也不同，所以，利用白細胞分化不同階段出現(xiàn)的細胞表面標志，可以對白血病進行免疫分型，對其進行導(dǎo)向治療10。近年，白血病的MICM(形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)和細胞遺傳學(xué)，分子生物學(xué))分型已成為現(xiàn)代白血病診斷的重要指標，其中應(yīng)用流式細胞儀進行免疫表型的檢測在分型中發(fā)揮了越來越重要的作用，現(xiàn)已積累了豐富的應(yīng)用經(jīng)驗。它具有快速、客觀、準確、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，對白血病進行免疫分型具有極其重要的臨床診斷意義11。準確的免疫分型關(guān)鍵是區(qū)分正常細胞與白血病細胞，傳統(tǒng)的流式細胞儀白血病免疫分型依賴于白血病細胞的FSC/SSC特性來設(shè)定原始細胞群，然后根據(jù)門內(nèi)某些陽性單抗占門內(nèi)細胞的百分比來確定其抗原表達情況。很顯然，這種方法是不能將原始細胞與正常細胞完全分開的。隨著免疫學(xué)和遺傳學(xué)及流式細胞儀檢測技術(shù)的發(fā)展，由開始的主要采用間接免疫熒光標記法到直接免疫熒光標記法，從單色或雙色到利用CD45抗體標記設(shè)門法進行多色免疫標記。利用造血系統(tǒng)細胞CD45表達量與細胞分化程度的高度相關(guān)性，可以精確地將原始/幼稚細胞與正常成熟細胞群完全分開。使免疫分型的準確性得到很大的提高，現(xiàn)在，已成為診斷白血病免疫分型的重要工具12。國際上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45SSC設(shè)門法，并結(jié)合其他技術(shù)進行免疫分型。如應(yīng)用流式細胞儀，采用CD45 SSC 設(shè)門法多參數(shù)，并利用抗體積分系統(tǒng)診斷標準，可以準確地、完整地分析白血病免疫分型13。采用三色流式細胞術(shù)CD45/側(cè)散射(SSC) 雙參數(shù)散點圖設(shè)門，并結(jié)合FAB 形態(tài)學(xué)能對急性白血病進行準確分型14。應(yīng)用流式細胞儀四色熒光標記技術(shù)， CD45/SSC雙參數(shù)散點圖設(shè)門方法，能清楚地區(qū)分各種免疫細胞，可準確、客觀地進行白血病免疫分型15。2.3血小板膜表面受體檢測血小板膜上有豐富的糖蛋白受體，是血小板發(fā)揮其功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，靜止期和活化期的血小板膜糖蛋白受體的種類、含量、結(jié)構(gòu)和功能顯著不同。應(yīng)用流式細胞儀檢測血小板膜上受體，主要是對血小板特異性膜糖蛋白和活化標志物進行免疫熒光標記，結(jié)合單克隆抗體和免疫熒光技術(shù)，用不同的抗血小板單克隆抗體，可以從分子水平上診斷血小板功能和數(shù)量的異常。使用流式細胞儀測定活化血小板是目前公認的快捷而靈敏的方法之一16，可直接、靈敏、特異地分析血小板的活化程度和功能狀態(tài)。普遍采用的技術(shù)是以全血為標本，應(yīng)用流式細胞儀進行多參數(shù)分析，即全血法流式細胞術(shù)。如采用流式細胞儀三色熒光標記技術(shù)，能準確地檢測冠心病患者血小板表面糖蛋白的變化17。采用流式細胞儀和三色免疫熒光標記的單克隆抗體，可直接檢測全血樣本中血小板膜表面CD41、CD61、CD62的表達水平18。與常規(guī)血小板功能測定法相比，全血法流式細胞術(shù)雖然有許多優(yōu)點，如直接使用全血樣本，且標本用量少；簡化標本的處理，避免了樣本處理不當?shù)纫蛩貙?dǎo)致的血小板體外激活，并可防止血小板亞群的丟失，從而更客觀、更準確地反映血小板的功能19。但是，全血法流式細胞術(shù)也存在不足之處，如流式細胞儀價格昂貴，為了避免血小板體外活化，血樣不能久置，需在45 min內(nèi)處理；只能分析循環(huán)中的血小板的數(shù)量和功能，不能反映血小板代謝和最近被清除的血小板的數(shù)量。所以，還需對該方法進行更深入的研究，并使之標準化20。2.4細胞因子的檢測細胞因子(cytokine)是由免疫細胞或非免疫細胞合成和分泌的小分子多肽，在調(diào)節(jié)機體多種細胞的生長、分化和功能，調(diào)節(jié)正常與病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答過程中起著十分重要的作用。檢測細胞因子對于闡明機體免疫應(yīng)答機制及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和臨床治療具有重要意義。隨著研究的進展，僅僅對細胞進行定量和活性的檢測已不能滿足需要。目前，越來越重視在單細胞水平上研究細胞因子的表達能力。應(yīng)用流式細胞儀結(jié)合間接免疫熒光法，可在單細胞水平上客觀、正確地檢測細胞內(nèi)多個細胞因子，并可區(qū)分表達特定細胞因子的細胞亞群，進行多參數(shù)相關(guān)分析，是一種有效地在單細胞水平研究細胞因子的方法21。近年主要采用的是胞內(nèi)流式分析法。該方法是基于BD公司的快速免疫細胞因子系統(tǒng)(fast Immune cytokine system)。以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)，佛波酯(phorbol myristate acetate， PMA)加離子霉素(ionomycin，Ion)作刺激劑， 刺激全血中淋巴細胞表達細胞因子；用雷菲德菌(Brefeldin A，BFA)與莫能霉素(monensin，MN)等藥物阻斷細胞因子分泌至胞外，用CD3和CD8設(shè)門，應(yīng)用兩種免疫熒光抗體同時標記淋巴細胞膜表面特異分子和被阻滯在胞內(nèi)的細胞因子，然后用流式細胞儀進行檢測和分析。該方法具有許多優(yōu)點，如完善的全血激活方法，保留體內(nèi)細胞及生化微環(huán)境，能更準確反映體內(nèi)狀況，避免了人工假象的產(chǎn)生。高效熒光結(jié)合抗體，確保高度靈敏及低背景染色。高質(zhì)量的膜通透劑，可以保證一致的靈敏度與低背景染色，且免除了為增加通透性所需冷凍細胞過夜的步驟。同型對照，避免了使用重組細胞因子進行繁瑣的競爭性封閉。該技術(shù)雖然已成為一項可在單細胞水平上檢測細胞因子的有效方法，尤其是在確定功能不同的T細胞亞群方面具有重要的作用22，具有其他方