菘藍葉片離體培養(yǎng)及植株再生-作業(yè).doc

激素對菘藍葉片組織培養(yǎng)的影響姓名：張亞洲 專業(yè)：農(nóng)學(xué)（本碩連讀） 班級：10-1 學(xué)號：20100099 指導(dǎo)老師：劉帆 倪蘇摘要：本研究以菘藍葉片為外植體，為了研究不同激素及其組合對菘藍離體葉片的生長的影響，通過對離體消毒的菘藍葉片采用四種不同激素配比的培養(yǎng)基進行比較培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)在相同濃度的6-BA+NAA培養(yǎng)基中NAA在誘導(dǎo)叢生芽中，適宜低濃度的NAA有助于叢生芽的發(fā)生且叢生芽誘導(dǎo)效果好，生長健壯，并在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)隨著濃度的升高對叢生芽的生長的抑制作用加強；在相同濃度的2,4-D+KT培養(yǎng)基中，2,4-D對菘藍葉的愈傷組織的形成有一定的抑制作用，并且對于叢生芽的形成也有較強的抑制作用。但對于其最強的抑制誘導(dǎo)叢生芽和愈傷組織的濃度還有待進一步試驗。關(guān)鍵詞：菘藍葉片；激素配比；比較培養(yǎng)；愈傷組織；芽。 菘藍( Isatis indigotica Fort. )是常用中藥板藍根和大青葉的主要來源植物，具有清熱解毒、涼血利咽、解熱、抗炎的功效，廣泛用于各種方劑1。以往對菘藍的研究多集中于其根板藍根化學(xué)成分和藥理作用(7,8,10）。但由于板藍根作為一種用量極大且長期銷售不衰的藥材，市場需求很大。迫切需要生產(chǎn)大量且無病毒植株來滿足市場需求，因此人們逐步將植物組織培養(yǎng)這一新技術(shù)應(yīng)用與菘藍根。有關(guān)菘藍的組織培養(yǎng)前人已經(jīng)做了一些階段性研究11,12,如余紹華用菘藍嫩葉、葉柄和嫩莖為外植體2，陳秋芳、孟玉玲等以葉片作外植體，陳薇等以下胚軸為外植體建立了菘藍的快速繁殖體系3-5，張勝珍研究了菘藍葉片原生質(zhì)體的游離、純化6，張菊紅等9應(yīng)用正交設(shè)計方法,對愈傷組織的誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基進行了優(yōu)化篩選。本研究，將針對離體消毒的菘藍葉片采用四種不同激素配比的培養(yǎng)基進行比較培養(yǎng),觀察不同激素配比對菘藍葉片愈傷組織的形成和芽的分化的影響，對其誘導(dǎo)分化的速度和誘導(dǎo)率進行分析，從而為進一步優(yōu)化現(xiàn)有對菘藍的組織培養(yǎng)技術(shù)提供重要的參考依據(jù)。1 材料與方法1.1 供試材料菘藍幼葉：由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理系提供。1.2 試驗方法 1.2.1 材料處理剪取生長正常的菘藍葉片3-4cm，用紗布包好，置流水下沖洗20-30min。在已滅菌的超凈工作臺中，用75%的酒精消毒10s，無菌水水漂洗3次；再用0.1%升汞進行消毒10min，每隔1分鐘輕輕震蕩一次，再用無菌水漂洗4次，消毒完成后用將材料放在已消毒的無菌皿上待用。1.2.2 接種 用消過毒的手術(shù)刀切取已處理好的菘藍葉片0.30.5cm左右的小片，再用鑷子，取3片接種到滅菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基上（MS培養(yǎng)基/500ml：大量元素/50mL、微量元素/5mL、微量元素/0.5mL、鐵鹽/5mL、有機物/0.5mL、甘氨酸/1mL、肌醇/50mg），封口。1.2.3 培養(yǎng)觀察 先進行一周后的黑暗培養(yǎng)，再將菘藍葉片轉(zhuǎn)入不同激素組合的離體培養(yǎng)基（表 1）中，放在1500lx-1800lx的光照（14小時/天），252的條件下培養(yǎng)。兩周后取生長良好的與菘藍幼葉的瘀傷組織接種到已滅菌的繼代培養(yǎng)基配培養(yǎng)（繼代培養(yǎng)基/500ml：蔗糖/15g、瓊脂/2.5g、肌醇/50mg、MS/50mL、6-BA/1mg、NAA/0.25mg，pH為5.8），放在1500lx-1800lx的光照（14小時/天），252的條件下培養(yǎng)。觀察，并記錄數(shù)據(jù)。表1 不同激素組合培養(yǎng)基（500ml）組別蔗糖/g瓊脂/g肌醇/mg不同激素組合培養(yǎng)基2152.550MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L3152.550MS+6-BA 2.0 mg/L +NAA 0.5 mg/L4152.550MS+2,4-D 1.0 mg/L +KT 0.5 mg/L5152.550MS+2,4-D 2.0 mg/L +KT 0.5 mg/L （注：配制好后，調(diào)pH為5.8，高壓滅菌后備用）1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 記錄培養(yǎng)不同培養(yǎng)基組合對菘藍葉片的啟動效果（污染數(shù)、存活數(shù)），以及觀察葉片形態(tài)變化狀況。2 結(jié)果與分析通過記錄不同培養(yǎng)基中菘藍葉片的存活率以及死亡原因如表2，發(fā)現(xiàn)2號和4號培養(yǎng)基真菌的平均污染率為1.4%相比3號和5號培養(yǎng)基的平均污染率6.51%出現(xiàn)較低；方差分析結(jié)果數(shù)據(jù)無問題，平均真菌感染率為4.0%，但對于造成這種規(guī)律的原有待進一步實驗證明。通過對細菌污染率進行方差分析發(fā)現(xiàn)，5號培養(yǎng)基差異顯著，故5號培養(yǎng)基不能作為分析數(shù)據(jù)，求剩余數(shù)據(jù)的平均值，得出該試驗細菌感染率為3.3%。通過記錄培養(yǎng)不同培養(yǎng)基組合對菘藍葉片的啟動效果，得出表2數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中不同種類的激素和激素配比對菘藍幼葉片的分化效率有一定的影響。通過觀察2號培養(yǎng)基菘藍葉片在添加了NAA和6-BA的MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)一周左右的時間，發(fā)現(xiàn)葉片開始增厚一腫脹一鼓起，21d左右有不定芽原基從葉片邊緣產(chǎn)生(圖1中2號)，34d不定芽高度可以達到3-4cm(圖1中2號)。而觀察不同培養(yǎng)基組合的菘藍葉片離體培養(yǎng)的生長狀況（如表2與圖1）。通過整體對比可以看出2號和號培養(yǎng)基的激素配比最適合菘藍誘導(dǎo)叢生芽的離體培養(yǎng)，4號和5號培養(yǎng)基最適合菘藍誘導(dǎo)愈傷組織的離體培養(yǎng)。通過2號與3號培養(yǎng)基片相比誘導(dǎo)出較多的叢生芽，叢生芽多而繁、高而細，2號只有少數(shù)生芽點出現(xiàn)，大多數(shù)矮而胖，總的來說2號的比3號長勢要好，一方面表明2號（MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1 mg/L）的培養(yǎng)基更有利于誘導(dǎo)出叢生芽，誘導(dǎo)出的叢生芽健壯，個體較大；另一方面表明隨著NAA濃度的下降，叢生芽誘導(dǎo)數(shù)量及生長狀況有下降趨勢。通過4號與5號培養(yǎng)基片相比，4號培養(yǎng)基也有叢生芽誘導(dǎo)出，但是都很小，肉眼要仔細觀察才能觀察到，其主要表現(xiàn)在于出現(xiàn)了較多的愈傷組織；而5號只有葉片卷曲，少數(shù)膨脹，有些邊緣發(fā)黑，愈傷組織很少。從而表明4號培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織生長情況比5號培養(yǎng)基的好,而叢生芽生長隨2.4-D濃度的升高而加強。圖1. 離體培養(yǎng)菘藍葉片葉片形態(tài)序號接種數(shù)/個污染數(shù)/支污染率/%存活數(shù)存活率葉片形態(tài)觀察真菌細菌真菌細菌2280103.572692.86葉片膨大，卷曲，增厚有20個重生芽出現(xiàn)328217.143.572589.28葉片膨大，卷曲，增厚有10個重生芽點出現(xiàn)435112.82.83394.29葉片卷曲變大有愈傷組織形成534225.885.882985.29葉片卷曲，葉緣變黃或變褐有愈傷組織形成表2.不同培養(yǎng)基組合啟動效果觀察統(tǒng)計3 結(jié)論與討論 植株組織培養(yǎng)技術(shù)是獲得無毒植物的重要方法，是植物生物工程技術(shù)研究的基礎(chǔ)，而植株組織培養(yǎng)是一個復(fù)雜的技術(shù)體系，與植株本身的激素水平和培養(yǎng)基中的生長調(diào)節(jié)劑濃度密切相關(guān)。在組織培養(yǎng)中，人們常用生長素和細胞分裂素誘導(dǎo)已分化細胞脫分化。2，4-D一般有利于愈傷組織的形成，但對芽的分化有強烈的抑制作用，本試驗材料也不例外，在加入2，4一D的培養(yǎng)基上，不能誘導(dǎo)出不定芽，即使再加入6-BA也不行。NAA和2，4一D都是生長素類物質(zhì)，單純的NAA或與6-BA組合，都可以誘導(dǎo)不定芽的分化。胡東楠等13，認為隨著培養(yǎng)基中6-BA與NAA相對比例的升高，不定芽的分化率會增高。在本試驗中，當(dāng)NAA l.0mg/L，6-BA 0.5mg/L時分化率較高，NAA為0.5 mg/L時的誘導(dǎo)率均低于6-BA為0.1 mg/L時分化率。且叢生芽生長健壯。同時也得出2，4-D在同等的KT的培養(yǎng)基上，低濃度的2，4-D更有利于愈傷組織的生長，因此2，4-D對愈傷組織有一定的生長抑制作用。試驗結(jié)果表明，菘藍葉片不易通過愈傷組織發(fā)生不定芽，可以不經(jīng)過愈傷組織階段直接誘導(dǎo)發(fā)生叢生芽，在誘導(dǎo)叢生芽時，不但要考慮誘導(dǎo)污染率的問題，同時也應(yīng)該考慮誘導(dǎo)分化形態(tài)發(fā)育程度。在以菘藍葉片為外植體誘導(dǎo)叢生芽時，得出在相同濃度的6-BA+NAA培養(yǎng)基中NAA在誘導(dǎo)叢生芽中，適宜低濃度的NAA有助于叢生芽的發(fā)生且叢生芽誘導(dǎo)效果好，生長健壯，并在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)隨著濃度的升高對叢生芽的生長的抑制作用加強；在相同濃度的2,4-D+KT培養(yǎng)基中，2,4-D對菘藍葉的愈傷組織的形成有一定的抑制作用，并且對于叢生芽的形成也有較強的抑制作用。但對于其最強的抑制誘導(dǎo)叢生芽和愈傷組織的濃度還有待進一步試驗。參考文獻：1 張潤珍, 張玉文. 板藍根的研究進展J. 中草藥, 2000, 31(6): 474-476.2 余紹華. 菘藍的組織培養(yǎng)J. 四川師范學(xué)院學(xué)報, 1991, 12(4): 358-361.3 陳秋芳, 群策, 秦廣雍. 菘藍葉片離體培養(yǎng)與試管無性系的建立J. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 38(12):98-100.4 孟玉玲. 菘藍子葉直接誘導(dǎo)叢生芽J. 中草藥, 1995, 20(1): 52.5 陳薇, 杜利云, 寸守銑, 等. 菘藍下胚軸組織離體培養(yǎng)J. 藥學(xué)實踐雜志, 2000, 18(5): 337-339.6 張勝珍, 客紹英, 馬作東, 等. 菘藍葉肉原生質(zhì)體游離與純化研究J. 中藥材,2009,5(32): 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