基因工程載體的分類及其特性.docx

UMBRELLA基因工程載體的分類及其特性田文曉 1343001125l 按照來(lái)源和性質(zhì)分類1、 質(zhì)粒載體 復(fù)制：通常情況下一個(gè)質(zhì)粒含有一個(gè)與相應(yīng)的順式作用控制要素結(jié)合在一起的復(fù)制起始區(qū)。在不同的質(zhì)粒中，復(fù)制起始區(qū)的組成方式不同，有的可決定復(fù)制的方式，例如滾環(huán)復(fù)制和復(fù)制；在大腸桿菌中使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于 pMB1 質(zhì)粒或 ColE1 質(zhì)粒的復(fù)制起始位點(diǎn)。 拷貝數(shù)：質(zhì)粒拷貝數(shù)分為嚴(yán)謹(jǐn)型與松馳型。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒每個(gè)細(xì)胞中拷貝數(shù)大約為1 幾個(gè)；松馳型質(zhì)?？截悢?shù)較多，可達(dá)幾百。 不相容性：兩個(gè)質(zhì)粒在同一宿主中不能共存的現(xiàn)象稱質(zhì)粒的不相容性，它是指在第二個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入后，在不涉及 DNA 限制系統(tǒng)時(shí)出現(xiàn)的現(xiàn)象。不相容的質(zhì)粒一般都利用同一復(fù)制系統(tǒng)，從而導(dǎo)致不能共存于同一宿主中。兩個(gè)不相容性質(zhì)粒在同一個(gè)細(xì)胞中復(fù)制時(shí)，在分配到子細(xì)胞的過程中會(huì)競(jìng)爭(zhēng)，隨機(jī)挑選，微小的差異最終被放大，從而導(dǎo)致在子細(xì)胞中只含有其中一種質(zhì)粒。 轉(zhuǎn)移性：指在自然條件下，很多質(zhì)?？梢酝ㄟ^稱為細(xì)菌接合的作用轉(zhuǎn)移到新宿主內(nèi)。它需要移動(dòng)基因 mob ，轉(zhuǎn)移基因 tra ，順式因子 bom 及其內(nèi)部的轉(zhuǎn)移缺口位點(diǎn) nic。2、 噬菌體載體（包括噬菌體、M13噬菌體載體）1) 噬菌體載體：大的外援插入片段在質(zhì)粒中不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)導(dǎo)是比轉(zhuǎn)化效率更高的過程，避免出現(xiàn)無(wú)插入片段的空載體。2) M13噬菌體載體：可以對(duì)任意克隆基因進(jìn)行DNA進(jìn)行誘變，測(cè)序方便，可以制備單鏈測(cè)序模板；含有噬菌體DNA的噬菌體顆粒從轉(zhuǎn)化細(xì)胞中分泌出來(lái)后，可以在生長(zhǎng)平板上收集。 超感染免疫性：溶原性細(xì)菌在被噬菌體感染并溶原化后，不會(huì)被同種噬菌體再次感染。 經(jīng)過若干世代后，溶原性細(xì)菌會(huì)開始進(jìn)入溶菌周期，即溶原性細(xì)菌的誘發(fā)。此時(shí)，原噬菌體從宿主基因組上切離下來(lái)進(jìn)行增殖。3、 粘粒載體（柯斯質(zhì)粒） 具有噬菌體的特性?？滤官|(zhì)粒載體在克隆了合適長(zhǎng)度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細(xì)胞。但該載體不包含噬菌體的全部必要基因，因此不能夠通過溶菌周期，無(wú)法形成子代噬菌體顆粒。 具有質(zhì)粒載體的持性?？滤官|(zhì)粒載體具有質(zhì)粒復(fù)制子，因此在寄主細(xì)胞內(nèi)能夠像質(zhì)粒DNA一樣進(jìn)行復(fù)制，并且在氯霉素作用下，同樣也會(huì)獲得進(jìn)一步的擴(kuò)增。此外，柯斯質(zhì)粒載體通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重組體分子表型選擇標(biāo)記。 具有高容量的克隆能力?？滤官|(zhì)粒載體的分子僅具有一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一兩個(gè)選擇記號(hào)和COS位點(diǎn)等三個(gè)組成部分，其分子量較小，一般只有57kb左右。因此，柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達(dá)45kb左右。 具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。一旦柯斯質(zhì)粒與一種帶有同源序列的質(zhì)粒共存在同一個(gè)寄主細(xì)胞當(dāng)中時(shí)，它們之間便會(huì)形成共合體。因此，假若柯斯質(zhì)粒與質(zhì)粒各自具有一個(gè)互不相同的抗藥性記號(hào)及相容性的復(fù)制起點(diǎn)，那么當(dāng)他們轉(zhuǎn)化到同一寄主細(xì)胞之后，便可容易的篩選出含有兩個(gè)不同不同選擇記號(hào)的共合體分子。4、 病毒載體 轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高、復(fù)雜的裝配過程由細(xì)胞完成、不同病毒載體具有不同表達(dá)特點(diǎn)。 根據(jù)病毒載體在主細(xì)胞中的存在情況分為瞬時(shí)表達(dá)病毒載體和穩(wěn)定表達(dá)病毒載體。5、 人工染色體 可以容納更長(zhǎng)的DNA片段，用較少的克隆就可以包含特定的基因組全部序列，從而保持了基因組特定序列的完整性，有利于物理圖譜的制作。l 按照功能和用途分類1、 克隆載體（又分為質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工微小染色體特征如上方的按來(lái)源的分類） 能在宿主細(xì)胞中復(fù)制繁殖，而且最好要有較高的自主復(fù)制能力。 容易進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且進(jìn)入效率越高越好。 容易插入外來(lái)核酸片段，插入后不影響其進(jìn)入宿主細(xì)胞和在細(xì)胞中的復(fù)制。這就要求載體DNA上要有合適的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。 容易從宿主細(xì)胞中分離純化出來(lái)， 這才便于重組操作。 有容易被識(shí)別篩選的標(biāo)志，當(dāng)其進(jìn)入宿主細(xì)胞、或攜帶著外來(lái)的核酸序列進(jìn)入宿主細(xì)胞都能容易被辨認(rèn)和分離出來(lái)。這才介于克隆操作。2、 表達(dá)載體（包括原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體）1) 原核表達(dá)載體：繁殖迅速、培養(yǎng)簡(jiǎn)單、操作方便、遺傳穩(wěn)定，基因克隆及表達(dá)系統(tǒng)成熟完善，全基因測(cè)序完成，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物。2) 真核表達(dá)載體：基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作方便，技術(shù)成熟，成本低廉，不含特異性病毒，不產(chǎn)生內(nèi)毒素，安全性高。 表達(dá)載體(Expression vectors)就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件(如啟動(dòng)子、RBS、終止子等)，使目的基因能夠表達(dá)的載體。3、 測(cè)序載體 測(cè)序載體包括單鏈載體、雙鏈載體，如M13、Puc系列，PGEM系列。測(cè)序載體一般含有一段多酶切位點(diǎn)區(qū)，便于外源DNA片段的插入、重組。在插入片段的旁邊，有合適的測(cè)序引物互補(bǔ)序列。雙鏈DNA載體，可以從插入片段的兩側(cè)同時(shí)測(cè)定DNA鏈的順序，故提高了測(cè)序效率。4、 轉(zhuǎn)化載體 為了把任何一個(gè)基因或DNA序列整合到所要的生物體基因組，把來(lái)自所要的生物體的一個(gè)基因或DNA序列克隆進(jìn)一個(gè)環(huán)狀載體，通過同源重組整合進(jìn)基因組。用同一種載體克隆外源DNA序列后去轉(zhuǎn)化該生物體，通過轉(zhuǎn)化載體和整合載體之間的同源性而插入，將外源DNA序列插入該生物體基因組。5、 穿梭載體 這類載體不僅具有細(xì)菌質(zhì)粒的