基因突變的蛋白質(zhì)效應(yīng).doc

母源性3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥臨床及基因突變分析【摘要】 目的 報(bào)告5例母源性3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（maternal 3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD），通過(guò)基因突變分析證實(shí)其臨床診斷。 方法 將串聯(lián)質(zhì)譜新生兒篩查發(fā)現(xiàn)3-羥基異戊酰肉堿（C5-OH）增高的5例新生兒及其母親納入研究。用尿氣相色譜質(zhì)譜分析進(jìn)行MCCD臨床診斷；基因突變檢測(cè)及功能分析明確診斷。 結(jié)果 （1）發(fā)現(xiàn)5例無(wú)癥狀母親血C5-OH濃度明顯增高，尿3-羥基異戊酸、3-甲基巴豆酰甘氨酸增高，診斷為良性MCCD。其新生兒血C5-OH濃度增高，3例隨訪后濃度逐步下降或達(dá)正常。（2）發(fā)現(xiàn)4種MCCC1基因新變異：c.ins1680A（25%）、c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P、c.639+5GT和2種MCCC2基因突變c.1406GT/p.R469L（新變異）及 c.592CT/p.Q198X。新變異可能影響蛋白結(jié)構(gòu)和功能。結(jié)論 對(duì)篩查血C5-OH增高的新生兒母親應(yīng)常規(guī)檢測(cè)以診斷母源性MCCD。MCCC1基因突變多見(jiàn)。【關(guān)鍵詞】3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥；3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶；基因突變；質(zhì)譜分析3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase deficiency，MCCD）（OMIM 210200/210210）是一種亮氨酸代謝障礙所致的常染色體隱性遺傳的有機(jī)酸代謝缺陷病，1970年由Eldjarn等首次報(bào)道1。因基因MCCC1（MIM*609010）或MCCC2（MIM*609010）突變導(dǎo)致亮氨酸代謝途徑中3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶（3-Methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase，MCC）缺乏，3-甲基巴豆酰輔酶A不能轉(zhuǎn)化成3-甲基戊烯二酰輔酶A而堆積，導(dǎo)致血3-羥基異戊酰肉堿（3-hydroxy-isovalerylcarnitine，C5-OH）增高、尿3-甲基巴豆酰甘氨酸（3-methylcrotonyl-glycine，3-MCG）和/或3-羥基異戊酸（3-hydroxy isovalerate，3-HIVA）代謝產(chǎn)物增多?；颊叩呐R床表型變異較大，多數(shù)無(wú)癥狀，少數(shù)可表現(xiàn)為嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)受損2。部分發(fā)達(dá)國(guó)家于20世紀(jì)90年代初應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜（tandem mass spectrometry，MS/MS）開(kāi)展新生兒篩查，統(tǒng)計(jì)顯示MCCD發(fā)生率約為1/36 0002-4。國(guó)內(nèi)研究相對(duì)滯后，我們自2003年起率先在國(guó)內(nèi)開(kāi)展MS/MS新生兒篩查，對(duì)血C5-OH濃度增高的新生兒，常規(guī)對(duì)其父母進(jìn)行MS/MS分析，迄今已發(fā)現(xiàn)5例母源性MCCD。而國(guó)內(nèi)除個(gè)別MCCD病例報(bào)道外5-6，尚未見(jiàn)母源性MCCD及基因研究報(bào)道。本文報(bào)道5例母源性MCCD臨床、生化表型及轉(zhuǎn)歸，以及基因突變分析結(jié)果，以從分子生物學(xué)水平證實(shí)其臨床診斷。1 對(duì)象與方法1.1 對(duì)象 2003年至2012年9月，我們對(duì)491 700名新生兒采用MS/MS進(jìn)行遺傳代謝病篩查，發(fā)現(xiàn)60余例新生兒血C5-OH濃度高于正常切值0.6 mmol/L，對(duì)其父母進(jìn)行MS/MS分析，發(fā)現(xiàn)5例母親（22 31歲）血C5-OH濃度明顯增高（5.11 21.77）mol/L，其中4例伴游離肉堿（free carnitine，C0）降低（2.6 6.76）mol/L。5例母親平素體健、孕期及分娩均無(wú)臨床癥狀；分娩的新生兒篩查時(shí)血C5-OH濃度增高（1.63 11.43）mol/L，臨床無(wú)癥狀（表1）。1.2 方法1.2.1 臨床診斷及隨訪：（1）采用尿氣相色譜質(zhì)譜儀（gas chromatography mass spectrometry，GC/MS）對(duì)血C5-OH增高相關(guān)的有機(jī)酸代謝病進(jìn)行診斷與鑒別診斷；（2）生物素酶活性測(cè)定以排除生物素酶缺乏；（3）生化檢測(cè)包括乳酸、血氨、肝腎功能、血?dú)?、酮體等；（4）每3月 1年對(duì)5例新生兒隨訪，評(píng)估臨床癥狀、生長(zhǎng)及智能發(fā)育等，復(fù)查血MS/MS、尿GC/MS，了解臨床轉(zhuǎn)歸。1.2.2 基因分析 基因突變檢測(cè) 在知情同意的原則下，采集外周血抽提父母及新生兒、50個(gè)正常對(duì)照者基因組DNA；參考文獻(xiàn)7和Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增MCCC1基因19個(gè)外顯子和MCCC2基因17個(gè)外顯子及兩端內(nèi)含子序列；按常規(guī)方法和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序，Chromas軟件進(jìn)行突變分析（參考MCCC1 GenBank：NM_020166.3；MCCC2 GenBank：NM_022132.4）?；蛐伦儺惙治觯海?）正常對(duì)照者100個(gè)等位基因的相關(guān)片段測(cè)序分析以排除多態(tài)性可能。（2）PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析（PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）：采用BstX、AlwN兩種限制性內(nèi)切酶對(duì)c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P錯(cuò)義突變酶切分析。（3）逆轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)序：提取患者RNA，經(jīng)試劑盒TaKaRa PrimeScript RT Master逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行測(cè)序分析，以驗(yàn)證剪切突變c.639+5GT。（4）采用軟件Clustal（1.81）對(duì)不同物種MCCC1和MCCC2氨基酸序列比對(duì)分析，以了解新型錯(cuò)義突變位點(diǎn)氨基酸的保守性。（5）PolyPhen-2（http//pph2）、SIFT（/）、UniProt（/）和PDB（/pdb/home/home.do）軟件分析新變異是否對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。2 結(jié) 果2.1 臨床診斷及隨訪2.1.1 母親MCCD診斷 5例母親血MS/MS檢測(cè)結(jié)果顯示C5-OH濃度增高或伴C0降低，血異戊酰烯肉堿、丙酰肉堿、丙酰肉堿/乙酰肉堿濃度均正常；4例尿GC/MS結(jié)果顯示3-MCG增高為2.18 272，3-HIVA增高為3.86 499（表1），無(wú)3-羥基丙酸、甲基枸櫞酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、3-甲基戊烯二酸、2-甲基-3-羥基丁酸及酮體等排出；生物素酶活性正常；根據(jù)上述排除其它C5-OH增高相關(guān)的有機(jī)酸代謝病，結(jié)合臨床無(wú)癥狀，診斷為良性MCCD。2.1.2 子女診斷及隨訪 5例新生兒篩查時(shí)血C5-OH濃度（1.63 11.43）mol/L，出生2周召回時(shí)降至（1.01 9.37）mol/L（下降36.14%），2例尿GC/MS分析顯示3-HIVA或3-MCG略高，結(jié)合臨床無(wú)癥狀、生化檢查正常，診斷為母源性MCCD。例1和例2分別于生后2.2歲及4月隨訪時(shí)，血C5-OH降至正常；例4生后1.5月末次隨訪時(shí)，血C5-OH由11.43 mol/L降至5.81 mol/L（下降49.17%）；例2生后3周復(fù)查尿GC/MS時(shí)，尿3-HIVA降至正常；例4尿3-MCG仍微量排出；余2例未復(fù)查血尿。所有新生兒末次隨訪年齡（1-38）月時(shí)仍無(wú)臨床癥狀，生長(zhǎng)及智能發(fā)育正常。2.2 基因分析2.2.1 基因突變 4例母親及子女接受了基因分析：突變檢出率為87.5%（7/8）；共檢出4種MCCC1突變：其中c.ins1680A突變頻率最高，占25%（2/8），其他3種為c.203CT/p.A68V、c.572TC/p.L191P以及c.639+5GT，均未見(jiàn)報(bào)道。共檢出2種MCCC2突變：c.1406GT/p.R469L（未報(bào)道）及c.592CT/p.Q198X（已報(bào)道）。 4例子女均攜帶來(lái)源于母親的一個(gè)雜合突變。（表1，圖1）表1 5例MCCD母親及子女生化和基因突變結(jié)果 病例血C5-OH濃度血C0濃度尿3-HIVA尿3-MCG母突變1母突變2子女突變子女轉(zhuǎn)歸（C5-OH濃度）母 子/女母 子/女母 子/女母 子/女核苷酸改變 突變效果核苷酸改變 突變效果 117.16 4.666.76 ND499 N60 Nc.203CT* p.A68V*c.ins1680A* 插入突變同突變12.2歲降至正常 25.11 1.63N N20.3 8.72.18 Nc.572TC* p.L191P*c.639+5GT* 剪切突變同突變14月降至正常 35.62 2.346.55 ND3.86 N35 Nc.592CT p.Q198X c.1406GT* p.R469L* 同突變1未隨訪 421.77 11.434.36 N12.59 N272 1.33c.ins1680A* 插入突變同突變11.5月下降49 % 510.99 4.852.6 NND NND NNDNDND未隨訪 正常值0.6 mol/L10-60 mol/LT突變型和野生型逆轉(zhuǎn)錄測(cè)序； 1d：例3母子MCCC2突變；1e：例4母女MCCC1突變2.2.2 基因新變異分析 正常對(duì)照者100個(gè)等位基因中未檢出5種新變異，排除多態(tài)性可能。 PCR-RFLP分析：新變異c.203CT和c.572TC用BstX、AlwN兩種內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，結(jié)果提示BstX將對(duì)照者及父親酶切產(chǎn)生136 bp、117 bp兩個(gè)片段，c.203CT突變的等位基因由于不能被酶切而產(chǎn)生1個(gè)253 bp片段，故攜帶此雜合突變的母子將酶切產(chǎn)生253 bp、136 bp和117 bp 三個(gè)片段（圖2a）；AlwN將對(duì)照者酶切成137bp、128 bp兩個(gè)片段，c.572TC突變的等位基因不能被酶切而產(chǎn)生1個(gè)265 bp片段，攜帶此雜合突變的母子經(jīng)酶切產(chǎn)生265 bp、137 bp和128 bp三個(gè)片段，未獲得父親DNA（圖2b）。圖2 PCR-RFLP酶切圖 2a：BstX對(duì)例1 c.203CT突變酶切；2b：AlwN對(duì)例2 c.572TC突變酶切；P：母親患者；Z：子女；F：父親；N：對(duì)照者 剪接突變c.639+5GT經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄cDNA反向測(cè)序，結(jié)果顯示外顯子6出現(xiàn)148個(gè)堿基雜合缺失而引起剪接錯(cuò)誤（圖1c）。不同物種氨基酸序列比對(duì)：2種MCCC1錯(cuò)義突變（c.203CT/p.A68V，c.572TC/p.L191P）及1種MCCC2錯(cuò)義突變c.1406GT/p.R469L經(jīng)6個(gè)不同物種與人類(lèi)基因相應(yīng)位點(diǎn)氨基酸比對(duì)分析，MCCC1第68、191位和MCCC2第469位均為高度保守氨基酸（圖3）。圖3 3種新錯(cuò)義突變?cè)诓煌锓N中的氨基酸序列比對(duì) PolyPhen-2、SIFT、UniProt和PDB分析 3種新型錯(cuò)義突變經(jīng)PolyPhen-2評(píng)分0.9 1，SIFT評(píng)分均為0，突變導(dǎo)致蛋白的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，可能改變蛋白構(gòu)象而致?。海?）c.203CT/p.A68V突變位于生物素羧化作用部位（蛋白質(zhì)活性部位），突變導(dǎo)致68位丙氨酸變?yōu)槔i氨酸，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)改變并與73位纈氨酸主鏈形成新氫鍵，氨基酸殘基較野生型增大（圖4a）；（2）c.572TC/p.L191P突變位于ATP結(jié)合和生物素羧化作用部位（蛋白質(zhì)活性部位）且位于肽鏈-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)，突變導(dǎo)致191位亮氨酸變?yōu)楦彼?，?cè)鏈結(jié)構(gòu)改變并與187位絲氨酸主鏈形成新氫鍵，氨基酸殘基較野生型減小（圖4b）；（3）c.1406GT/p.R469L突變位于羧基轉(zhuǎn)移酶部位，突變導(dǎo)致469位精氨酸變成亮氨酸，側(cè)鏈結(jié)構(gòu)改變與468位丙氨酸主鏈間氫鍵消失，氨基酸殘基較野生型減小且具有更強(qiáng)的疏水性，電荷顯中性（野生型帶正電）（圖4c）。圖4 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)圖 紅色：突變位點(diǎn)氨基酸主鏈；粉色：側(cè)鏈；綠色虛線：氫鍵；粉色虛線：突變產(chǎn)生的新氫鍵；4a：c.203CT/p.A68V野生型和突變型；4b：c.572TC/p.L191P 野生型和突變型；4c：c.1406GT/p.R469L野生型和突變型3 討論MCCD的臨床表型差異較大，又分為有癥狀型，無(wú)癥狀型和母源型3種。嚴(yán)重者在新生兒期表現(xiàn)為喂養(yǎng)困難、陣發(fā)性嘔吐、腹瀉，抽搐、嗜睡、昏迷、呼吸暫停、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、肌張力異常等；臨床以無(wú)癥狀型多見(jiàn)2-4；母源型較少，即母親為MCCD，因其增高的C5-OH通過(guò)母乳或胎盤(pán)傳輸給新生兒8，導(dǎo)致新生兒篩查時(shí)血C5-OH增高，對(duì)父母檢測(cè)后才發(fā)現(xiàn)母親是MCCD患者。有些母親患者在禁食或高蛋白質(zhì)飲食下、尤其在孕期可出現(xiàn)肌病、肝酶增高、脂肪肝和易疲勞等癥狀。Gibson等9率先報(bào)道了4例MCCD母患共14次孕期及分娩史，其中僅1例曾出現(xiàn)上訴癥狀。Koeberl等10報(bào)道4例MCCD母患，除1例曾在高蛋白飲食后出現(xiàn)嘔吐外，其余均無(wú)癥狀。母源性MCCD新生兒通常生后篩查時(shí)血C5-OH濃度不同程度增高，隨訪一段時(shí)間可恢復(fù)正常9-11。本文在國(guó)內(nèi)首次報(bào)道了5例母源性MCCD，母親為良性MCCD，受影響的新生兒出生3天血C5-OH不同程度增高，隨訪后逐步下降或達(dá)正常（最長(zhǎng)隨訪至3歲），均無(wú)癥狀，生長(zhǎng)及智能發(fā)育正常，診斷為母源性MCCD（暫時(shí)性）。因此，對(duì)新生兒篩查發(fā)現(xiàn)血C5-OH增高者，需常規(guī)對(duì)其母親檢測(cè)以診斷母源性MCCD。MCCD與下列4種C5-OH增高疾病的鑒別主要依靠尿GC/MS。（1）多種?；o酶A羧化酶缺乏癥：除尿3-HIVA及3-MCG增高外，3-羥基丙酸、甲基枸櫞酸、甲基巴豆酰甘氨酸及酮體增高12；（2）3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A裂解酶缺乏癥：尿特異性3-羥-3-甲基戊二酸增高；（3）3-甲基戊二酰輔酶A水解酶缺乏癥：3-甲基戊烯二酸、3-甲基戊二酸增高；（4）b-酮硫解酶缺乏癥：大量酮尿及2-甲基-3-羥基丁酸增高。我們報(bào)告的MCCD母親患者及其子女的血、尿質(zhì)譜分析均排除了上述其他4種有機(jī)酸代謝病。無(wú)臨床癥狀的MCCD患者無(wú)需治療。對(duì)于有癥狀者可給予限制亮氨酸、蛋白質(zhì)飲食，而甘氨酸或生物素治療通常無(wú)效；對(duì)于伴游離肉堿缺乏者需要補(bǔ)充左旋肉堿；急性發(fā)作期患者應(yīng)給予葡萄糖、糾酸、維持電解質(zhì)平衡等治療13。MCCC1和MCCC2基因突變均可導(dǎo)致MCCD。MCCC1定位3q25-27區(qū)，包含19個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為2580 bp，編碼725個(gè)氨基酸多肽。MCCC2定位5q12-q13.1區(qū)，包含17個(gè)外顯子，長(zhǎng)度為2304 bp，編碼563個(gè)氨基酸多肽。MCCC1包含共價(jià)連接生物素的輔基及碳酸氫鹽和ATP的結(jié)合位點(diǎn)，MCCC2則包含?；o酶A酶作用物的結(jié)合位點(diǎn)即主要結(jié)合甲基巴豆酰輔酶A3。目前已報(bào)道MCCC1和MCCC2基因突變各60余種14-16，c.1155AC（p.R385S）為較常見(jiàn)的熱點(diǎn)突變。2012年韓國(guó)首次報(bào)道c.838GT（p.D280Y）為其熱點(diǎn)突變，日本于2007年也報(bào)道1例攜帶此突變17。本研究發(fā)現(xiàn)3例母親攜帶2個(gè)基因突變，1例僅找到1個(gè)雜合突變，可能因另一突變隱藏于非編碼區(qū)無(wú)法經(jīng)PCR直接測(cè)序檢出或其他不確定因素造成；新生兒均攜帶來(lái)自母親的1個(gè)雜合突變，為雜合子。MCCC1突變?yōu)镸CCD患者較常見(jiàn)的突變。已報(bào)道突變c.592CT/p.Q198X見(jiàn)于1例無(wú)癥狀新生兒篩查發(fā)現(xiàn)的MCCD患者，該突變位于羧基轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)使198位谷氨酰胺變?yōu)榻K止密碼子，影響了蛋白結(jié)構(gòu)和功能17。已發(fā)現(xiàn)的5種新變異均被證實(shí)可能對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響：c.203CT/p.A68V突變將產(chǎn)生新的氫鍵，氨基酸殘基較野生型增大，可能無(wú)法匹配蛋白質(zhì)的核心區(qū)域而影響蛋白的活性；c.572TC/p.L191P突變也產(chǎn)生新的氫鍵，氨基酸殘基較野生型減小，可能引起蛋白核心區(qū)域空缺，且突變后脯氨酸破壞-螺旋結(jié)構(gòu)，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重影響；c.1406GT/p.R469L突變引起氫鍵消失，氨基酸殘基較野生型減小，疏水性增強(qiáng)，電性改變可能造成和其他分子相互作用消失；c.ins1680A引起突變位點(diǎn)后第9個(gè)氨基酸提前出現(xiàn)TAA終止密碼子造成蛋白結(jié)構(gòu)改變；剪切突變c.639+5GT使外顯子6雜合缺失引起剪切錯(cuò)誤，造成蛋白結(jié)構(gòu)改變。因此，上述5種未報(bào)道的變異很可能是致病新突變，需進(jìn)一步體外蛋白功能表達(dá)研究驗(yàn)證。已有的研究提示MCCD表型和基因型間無(wú)明確的相關(guān)性，調(diào)控基因和環(huán)境因素等也可能影響表型。例如，較常見(jiàn)的MCCC1突變p.R385S可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床表型，但也可無(wú)癥狀，故難以通過(guò)基因型預(yù)測(cè)臨床表型3,11。因本研究病例較少，臨床無(wú)癥狀，難以分析基因型和表型的關(guān)聯(lián)性，尚需累積更多的病例進(jìn)行分析。參考文獻(xiàn)1 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