保健食品的微生物限度檢驗方法驗證淺析

保健食品的微生物限度檢驗方法驗證淺析,引言,隨著國民生活水平的提高，人們對生活的質(zhì)量也有了較高的要求，防病于未然的健康意識逐漸被人們所重視，保健食品隨之成為人們脫離亞健康的途徑之一。我國的保健食品概念是1996年保健食品管理辦法中的“標(biāo)明具有特定保健功能的食品。即適宜于特定人群食用，具有調(diào)節(jié)機體功能，不以治療疾病為目的的食品”。具有三種屬性：食品屬性；功能屬性(具有特定的功能)；非藥品屬性。然而劣質(zhì)的保健食品不僅不能提高人們的生活質(zhì)量，甚至威脅生命安全，因而保健食品的安全評價及質(zhì)量檢驗是保證人們使用合格產(chǎn)品的前提。,保健食品的質(zhì)量安全包括兩方面內(nèi)容：不以傳統(tǒng)食品為載體的保健食品具有其特有的安全問題。以傳統(tǒng)食品為載體的，要考慮相應(yīng)的食品安全問題，如以植物為來源的傳統(tǒng)食品當(dāng)考慮農(nóng)殘、植物生長刺激素等；以動物為來源則應(yīng)考慮抗生素、激素等。但同時作為保健食品特有的質(zhì)量安全問題，還須高度關(guān)注保健食品中加入化學(xué)藥物（如違法添加芬氟拉明、麻黃素或速尿的減肥產(chǎn)品；又如某些“補品”檢出了枸櫞酸西地那非，即偉哥的主成分），各種功效成份/提取物內(nèi)源性毒物安全（如中草藥毒性及長期服用安全性評價），新資源、新技術(shù)、功能性安全，進口保健食品，偽劣保健食品，非法添加物的檢驗等問題。,鑒于保健食品于近年來暴露出的一些質(zhì)量問題，中檢所和藥檢處統(tǒng)一部署，擴大我所檢驗范圍，開展對保健食品的質(zhì)量監(jiān)督檢驗工作，微生物限度作為食品藥品的必檢項目，顯示其基礎(chǔ)安全的重要性。我室于2005、06年進行了保健食品衛(wèi)生微生物學(xué)限度檢驗及方法學(xué)驗證實驗工作，完成了30多種購買樣品的試檢驗任務(wù)，以及幾個注冊品種的檢驗，涉及口服液、片劑、膠囊、茶劑等常見保健食品類型，結(jié)合食品國標(biāo)和藥典探討保健食品的檢驗方法及可行性，現(xiàn)對有檢驗情況匯報如下，供檢驗部門參考。,摘 要,我所按中國藥典2005版微生物限度法及方法學(xué)驗證法，對32種保健食品進行方法學(xué)驗證，結(jié)果表明其中15個品種（活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)膠囊、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊、全蟲草膠囊、再高鐵兒童成長口服液、血爾口服液、瞳神牌輕亮、養(yǎng)顏鹿胎粉、夢玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、二月紅牌紅潤片）分別對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌有抑菌作用，染菌回收率均低于70%。結(jié)果說明：1、采用GB/T4789.14789.31 2003食品微生物限度檢查法不能真實反應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量，因而不宜采用；2、應(yīng)分別采用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法進行方法學(xué)驗證。 3、微生物限度方法學(xué)驗證的必要性。,關(guān)鍵詞,方法學(xué)驗證、微生物限度、回收率、保健食品質(zhì)量。,一、實驗?zāi)康?確認對保健品進行微生物限度檢查時，所采用的細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法和控制菌檢查方法是否適合于該保健品的微生物限度檢查。,樣品,（1） 天元甘露低聚果糖液 20040701 云南綠色生物工程有限公司 （2） 維生素E（加州熊） 040902 濟南生命力生物科技有限公司 （3） 海王金樽 040712 深圳市海王健康科技發(fā)展有限公司 （4） 神奇壽樂牌排鉛沖劑 040210 常州市紅太陽工程有限公司 （5） 蓋中蓋高鈣片 20041207 哈藥集團制藥六廠 （6） 龍希膳食纖維膠囊 20030718 湖北恩施宏業(yè)魔芋開發(fā)有限責(zé)任公司 （7） 紫薇卵磷脂膠囊 20041119 清華紫光（集團）總公司 （8） 吾老七羊胎美容濃縮液 04092701 浙江蘅州市吾老七保健品有限公司 （9） 腦輕松膠囊 20041207 香港康富來國際企業(yè)有限公司 （10） 江中亮嗓胖大海 20040822 云南綠生物工程有限公司 （11） 江中活謂素得而樂膠囊 20041206 廣州藍鑰匙海洋生物工程有限公司 （12） 忘不了3A腦營養(yǎng) 20041107 山東禹王制藥有限公司,（13） 瞳神牌輕亮 04030101 北京輕爾特科技開發(fā)中心（14） 再高鐵兒童成長膠囊 20040920 廣州市紅虹生物科技有限公司（15） 血爾口服液 20040006 香港康富來國際企業(yè)有限公司（16） 金舒通膠囊 20040601-05 武漢名實醫(yī)藥科技有限責(zé)任公司（17） 仙牌靈芝茶 20050112 四川仙牌靈芝集團有限公司（18） 事輕松膠囊 20041026 武漢靜悟綠色保健研究所（19） 養(yǎng)顏鹿胎粉 040606 廣東廣濟堂醫(yī)藥保健品有限公司（20） 老君舒壓茶 20041218 成都物華生物制品有限公司（21） 夢玉膠囊 20050102 濟南生命生物科技有限公司（22）心態(tài)好（天一美樂寧片）031201 北京樂寧科技有限責(zé)任公司（23） 華濟堂牌護肝靈膠囊 20060517 美國德全高科技藥業(yè) 20060521 20060525,（24） 前烈立舒膠囊 QLS05222 香港奧美制藥廠（25） 二月紅牌紅潤片 2007042425050 中天(上海)營養(yǎng)食品有限公司（26） 紳寧寶膠囊 20050220、20050225香港康恩堂制藥有限公司（27） 博士倫博視康牌葉黃素片1515、1525、1535德國博士曼大藥廠（28） 全蟲草膠囊 2006210 西藏天知生物科技開發(fā)有限公司（29） 覺父膠囊 20050307、20050327 香港奧美制藥廠（30） 苦瓜精華素片 3117、3500 美國GSL科技有限公司（31） 寧烈寧膠囊 20050428、20050509 香港奧美制藥廠（32） 富威牌劍影膠囊 021333 北京富威生物科技開發(fā)公司,二、培養(yǎng)基,膽鹽乳糖增菌液 批號：040324 玫瑰紅鈉瓊脂 批號：050316 營養(yǎng)瓊脂 批號：050310 營養(yǎng)肉湯 批號：041010 改良馬丁瓊脂 批號：050520 改良馬丁瓊脂液體 批號：040302曙紅亞甲藍瓊脂 批號：040413 葡萄糖肉浸液肉湯 批號：040902EMB 批號：040413 麥康凱 批號：050608 血營養(yǎng)瓊脂 批號：050310 沙門、志賀菌屬瓊脂 批號：050121胰酪胨大豆肉湯 批號：050422 DHL 批號：0501274-甲基傘形酮葡萄糖苷(MUG) 050127 GN 批號：040224四硫酸鈉煌綠增菌液TTB 批號：040413 以上培養(yǎng)基均由中國藥品生物制品檢定所提供，另由本室本室自行配制膽鹽乳糖增菌液（小倒管）10ml 。,三、 菌種,枯草桿菌(Bacillus subtilis) CMCC(B)63501、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ) CMCC(B) 26003、大腸埃希菌（Escherichia coli） CMCC(F) 44102、白色念珠菌(Candida albicans) CMCC(F) 98001、 黑曲霉(Aspergillus niger) CMCC(F)98003 弗氏志賀菌（Shigella flexneri） CMCC(F)51573乙型溶血性鏈球菌（Hemolytic streptococcus） CMCC(F)32210沙門氏菌（Salmonella paratyphi）CMCC(B)50094,四、方法驗證,1、菌液制備：（1）取經(jīng)37培養(yǎng)18-24小時，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌、乙型溶血性鏈球菌、福氏痢疾肉湯培養(yǎng)物1ml+9ml鹽水10倍稀釋至10-5 10-7為50100CFU/ml，做活菌計數(shù)備用。（2）取經(jīng)25 培養(yǎng)1824小時的白色念珠菌霉菌液體培養(yǎng)物1ml+9 ml鹽水10倍稀釋至10-5 為50100CFU/ml，做活菌計數(shù)備用。（3）取經(jīng)25 培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加35ml鹽水洗下霉菌孢子，吸取出菌液， 用標(biāo)準(zhǔn)比濁管比濁，與濁度相當(dāng)后，取1 ml +9 ml鹽水=10-1，逐管10倍稀釋為10-4約50100CFU/ ml，做活菌計數(shù)備用。,菌液的檢驗,（1）取上述金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸埃希菌、乙型溶血型鏈球菌、福氏痢疾菌、沙門菌10-5 10-7稀釋液各1ml，用45營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿，3035培養(yǎng)48小時，計數(shù)，應(yīng)約為50100cfu/ml。（2） 取上述白色念珠菌10-5 10-6稀釋液及上述黑曲霉菌10-4孢子懸液各1ml，用45琥紅瓊脂培養(yǎng)基20ml注皿，各平行測定兩皿，2328培養(yǎng),逐日觀察計數(shù)，應(yīng)約為50100cfu/ml。,供試液制備,稱取樣品10 g ，加0.1%蛋白胨水氯化鈉稀釋液100ml濃度均為1：10供試液。,細菌、酵母菌及霉菌的方法學(xué)驗證,（1）常規(guī)法：采用加1：10供試液1ml，分別人工接種上述5種陽性代表試驗菌株，50100CFU/ml，再加1520 ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2448小時觀察結(jié)果細菌計數(shù)，測定回收率結(jié)果見表2。 （2）培養(yǎng)基稀釋法： 采用加0.5ml、0.2 ml、0.1 ml /皿供試液，人工接種上述敏感試驗菌株，再加1520 ml瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2448小時觀察結(jié)果細菌計數(shù)，測定回收率。結(jié)果見表3。（3）薄膜過濾法：分別取不同品種的1：10供試液取上清夜1ml加入濾器中、用0.1%蛋白胨氯化鈉稀釋液沖洗300ml/濾器再加規(guī)定敏感菌株沖洗后、取出濾膜貼規(guī)定培養(yǎng)基培養(yǎng)2472小時觀察結(jié)果見表4。,回收率測定：,（1）試驗組：分別取不同品種的1：10供試液1 ml、50100CFU/ ml 試 驗菌株同時加入平皿中，立即傾注瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)2472小時觀察結(jié)果。薄膜過濾法以最后一次的沖洗液加入試驗菌。（2）活菌組：測定每一菌株 加的試驗菌數(shù)見表1（3）供試液對照：測定供試品本底菌數(shù)（略）（4）稀釋劑對照組。,回收率的計算,按如下公式計算試驗組的加菌回收率：,（三）、控制菌檢查方法學(xué)驗證,當(dāng)建立藥品的微生物檢查法時，應(yīng)進行控制菌的方法學(xué)驗證，以確認所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查 （1）試驗組 取1：10供試液，接入100 ml/瓶5瓶膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基和3瓶亞碲酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基中，（10 ml供試液 /瓶）其中1瓶接種大腸埃希菌、福氏痢疾、沙門菌供試液瓶、稀釋劑對照組瓶；其中1瓶接種乙型溶血性鏈球菌、供試液瓶、置35培養(yǎng)經(jīng)2448小時結(jié)果見表5。,（2）陰性菌對照組 a 取金黃色葡萄球菌50100cfu/ ml，接種 膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)基中，置35培養(yǎng)經(jīng)2448小時，陰性菌對照菌組為陰性（未生長）。 b取大腸埃希菌50100cfu/ ml， 接種亞酸鹽肉湯增菌培養(yǎng)基中置35培養(yǎng)經(jīng)2448小時，陰性菌對照菌組為陰性（未生長）。,五、結(jié)果菌落計數(shù)表1 菌落計數(shù),表2 微生物限度檢查法驗證常規(guī)法接種陽性菌株的回收率（%）,注：2331為2006年檢驗，控制菌全部按國標(biāo)GB/T4789.14789.31 2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法進行檢驗從表2結(jié)果中可以看出：32個品種分別接種5株代表菌，有16個品種回收率均超過70%，可采用常規(guī)方法進行測定；另16個品種（活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)、再高鐵兒童成長口服液、血爾口服液、瞳神牌輕亮、養(yǎng)顏鹿胎粉、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、夢玉膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊、二月紅牌紅潤片、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、全蟲草膠囊）分別對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌有抑菌作用，染菌回收率%均低于70%，應(yīng)分別采用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過濾法進行方法學(xué)驗證。,表3 回收率小于70的品種采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2-0.5ml/皿）回收率（%）,從表3中結(jié)果看出,活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊等6個品種采用培養(yǎng)基稀釋法0.2ml/皿，全蟲草膠囊和富威牌劍影膠囊采用培養(yǎng)基稀釋法0.5ml/皿，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌和大腸桿菌回收率均超過70%，使細菌正常生長，可采用培養(yǎng)基稀釋法測定。再高鐵兒童成長口服液，養(yǎng)顏鹿胎粉經(jīng)培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）測定，對枯草桿菌回收率仍低于70%；二月紅牌紅潤片采用稀釋法進行檢測（0.5ml/皿）枯草桿菌回收率不穩(wěn)定，均低于70%，故用薄膜過濾法進行方法學(xué)驗證。而對回收率很低品種，血爾口服液、瞳神牌輕亮膠囊、夢玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片，可直接采用薄膜過濾法進行方法學(xué)驗證。,表16結(jié)果,132個品種其中天元甘露低聚果糖液、維生素E（加州熊）、海王金樽、神奇壽樂牌排鉛沖劑、新蓋中蓋高鈣片、龍希膳食纖維膠囊、紫薇卵磷脂膠囊、吾老七羊胎美容濃縮液、腦輕松膠囊、江中亮嗓胖大海、老舒君壓茶、前烈立舒膠囊、覺父膠囊、苦瓜精華素片、寧烈寧膠等16個品種可采用常規(guī)法進行試驗。2.活謂素得而樂膠囊、忘不了3A腦營養(yǎng)膠囊、金舒通膠囊、仙牌靈芝茶、事輕松膠囊、華濟堂牌護肝靈膠囊、全蟲草膠囊、富威牌劍影膠囊8個品種細菌數(shù)可采用培養(yǎng)基稀釋法測定。3. 血爾口服液、養(yǎng)顏鹿胎粉、再高鐵童少兒成長膠囊、瞳神牌輕亮、夢玉膠囊、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片和二月紅牌紅潤片8個品種細菌數(shù)可采用薄膜過濾法測定。,4. 2005年所檢的22個品種沒有測定沙門菌，對于其他控制菌無抑菌活性，可采用常規(guī)法進行測定。2006年所檢的10個品種其控制菌的檢查，按照國標(biāo)GB/T4789.14789.31 2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法測定了沙門菌，除華濟堂牌護肝靈膠囊采用培養(yǎng)基稀釋法進行測定，前烈立舒膠囊、二月紅牌紅潤片、紳寧寶膠囊、博士倫博視康牌葉黃素片、全蟲草膠囊、覺父膠囊、苦瓜精華素片、寧烈寧膠囊富威牌劍影膠囊，對霉菌、控制菌均無抑菌活性，均可采用常規(guī)法進行測定。,檢驗結(jié)果分析,目前，保健食品按國標(biāo)GB/T4789.14789.31 2003食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗方法進行檢驗，該標(biāo)準(zhǔn)中僅提供了一般檢驗方法，并沒有提供方法驗證的內(nèi)容和要求。而保健食品中一些成分和添加劑的使用往往對微生物的生長具有抑制作用，僅依據(jù)國標(biāo)（GB/T4789.14789.31 2003）方法無法去除這些因素對檢驗結(jié)果的影響，從而無法保證結(jié)果的科學(xué)、可靠。為此采用2005版中國藥典微生物限度檢查方法驗證的要求，對購買的34個保健食品樣品進行了微生物檢驗的方法學(xué)驗證實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大約50的樣品具有抑菌作用（見表1），高于中成藥30左右品種具有抑菌作用的比例，而且這些具有抑菌作用的品種大多可以采用培養(yǎng)基稀釋法去除抑菌活性（見表2），也有個別品種需要采用薄膜過濾法才能去除抑菌活性（見表3），這些情況也與中成藥微生物限度檢查方法驗證情況相似。,討論：,僅依據(jù)國標(biāo)GB/T