DNS比色法測(cè)定還原糖和總糖.doc

還原糖和總糖的測(cè)定(3,5-二硝基水楊酸比色法)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握還原糖和總糖測(cè)定的基本原理2、學(xué)習(xí)比色法測(cè)定還原糖的操作方法和分光光度計(jì)的使用二、實(shí)驗(yàn)原理還原糖的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類(lèi)。單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，例如乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用各種糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái)。對(duì)非還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成還原性單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量(常以葡萄糖含量計(jì))。還原糖在堿性條件下加熱可被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，而氧化劑3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以系數(shù)0.9。三、實(shí)驗(yàn)材料和試劑1、實(shí)驗(yàn)材料 面粉2、實(shí)驗(yàn)試劑 1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確稱(chēng)取80烘至恒重的分析純葡萄糖100mg，置于小燒杯中，加少量蒸餾水溶解后，轉(zhuǎn)移到100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至100ml，混勻，4冰箱中保存?zhèn)溆谩?3,5-二硝基水楊酸(DNS)試劑將6.3g DNS和262ml 2M NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。 碘-碘化鉀溶液：稱(chēng)取5g碘和10g碘化鉀，溶于100ml蒸餾水中。 酚酞指示劑：稱(chēng)取0.1g酚酞，溶于250ml 70%乙醇中。 6M HCl和6M NaOH各100ml。四、實(shí)驗(yàn)器材具塞玻璃刻度試管：20ml11 大離心管：50ml2燒杯：100ml1 三角瓶：100ml1容量瓶：100ml3 刻度吸管：1ml1；2ml2；10ml1恒溫水浴鍋 沸水浴離心機(jī) 扭力天平分光光度計(jì) 五、操作步驟1、制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線取7支具塞刻度試管編號(hào)，按表1分別加入濃度為1mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和DNS試劑，配成不同濃度的葡萄糖反應(yīng)液。表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作管 號(hào)1mg/ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液(ml)蒸餾水(ml)DNS(ml)葡萄糖含量(mg)光密度值(OD-540nm)0021.5010.21.81.50.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2將各管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5min取出，冷卻至室溫，用蒸餾水補(bǔ)足至10ml，加塞后顛倒混勻，在分光光度計(jì)上進(jìn)行比色。調(diào)波長(zhǎng)540nm，用0號(hào)管調(diào)零點(diǎn)，分別測(cè)出16號(hào)管的光密度值。以光密度值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。2、樣品中還原糖和總糖的測(cè)定 還原糖的提取準(zhǔn)確稱(chēng)取3.00g食用面粉，放入100ml燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后補(bǔ)足至50ml蒸餾水，攪勻，置50恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。將浸出液(含沉淀)轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，于4,000r/min離心5min，沉淀可用20ml蒸餾水洗一次，再離心，將兩次離心的上清液收集在100ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測(cè)液。 總糖的水解和提取準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00g食用面粉，放入100ml三角瓶中，加15ml蒸餾水及10ml 6M HCl，置沸水浴中加熱水解30min(用碘-碘化鉀溶液檢查水解是否完全)。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1滴酚酞指示劑，用6M/l NaOH中和至微紅色(至中性)，用蒸餾水定容在100ml容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過(guò)濾，取濾液10ml，移入另一100ml容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測(cè)液。 顯色和比色取4支具塞刻度試管，編號(hào)，按表2所示分別加入待測(cè)液和顯色劑，空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號(hào)管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。表2 樣品還原糖測(cè)定管 號(hào)還原糖待測(cè)液（mL）總糖待測(cè)液（mL）蒸餾水（mL）DNS（mL）光密度值（OD-540nm）查曲線葡萄糖量（mg）70.51.51.580.51.51.59111.510111.5五、結(jié)果與計(jì)算計(jì)算出7、8號(hào)管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上分別查出相應(yīng)的還原糖毫克數(shù)，按下式計(jì)算出樣品中還原糖和總糖的百分含量。查曲線所得葡萄糖毫克數(shù)提取液總體積/測(cè)定時(shí)取用體積還原糖(%) =100樣品毫克數(shù)查曲線所得水解后還原糖毫克數(shù)稀釋倍數(shù)總糖(%) =0.9100樣品毫克數(shù)六、注意1. 離心時(shí)對(duì)稱(chēng)位置的離心管必須配平2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作與樣品測(cè)定應(yīng)同時(shí)進(jìn)行顯色，并使用同一空白調(diào)零點(diǎn)比色3. 若比色液顏色過(guò)深，其吸光度可能超出標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍，可將樣液適當(dāng)稀釋后再顯色測(cè)定思考題1、3,5-二硝基水楊酸比色法是如何對(duì)總糖進(jìn)行測(cè)定的?2、如何正確繪制和使用標(biāo)準(zhǔn)曲線?3、比色測(cè)定時(shí)為什么要設(shè)計(jì)空白管？作 業(yè) 1. 寫(xiě)出b-D-脫氧核糖和a-D-半乳糖的Fischer投影式、 Haworth式和構(gòu)象式2. 糖分子環(huán)化時(shí)為什么會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的手性中心？3. 測(cè)量血糖含量時(shí)常使用Glc氧化酶，其催化反應(yīng)為： b-D-Glc + O2 葡糖酸內(nèi)酯 + H2O2， 但該酶僅對(duì)b-D-Glc特異，為什么可利用它來(lái)測(cè)定