谷氨酸生產(chǎn)菌及擴大培養(yǎng).ppt

三谷氨酸生產(chǎn)菌及擴大培養(yǎng) 教學內(nèi)容 1 了解谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 特點 2 掌握菌種的擴大培養(yǎng)方法 3 了解影響生產(chǎn)菌生長的主要因素 教學目的與要求 學時 4 作業(yè)安排 小論文 前言 一 谷氨酸菌種的選育進展 1 應(yīng)用常規(guī)育種技術(shù)及其所選育的谷氨酸高產(chǎn)新菌種 前言 2 谷氨酸生產(chǎn)菌抗噬菌株的選育 前言 3 采用遺傳工程新技術(shù)選育谷氨酸優(yōu)良菌種 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 1 幾種斜面培養(yǎng)基保存方法 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 2 磷酸鹽緩沖液保存方法的改進 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 3 試管熔封法保存谷氨酸菌種的研究 前言 二 谷氨酸生產(chǎn)菌保存方法 4 液氮超低溫保存谷氨酸菌種 第一節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征和菌學性質(zhì) 一 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬 短桿菌屬 小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細菌 這四個屬在細菌的分類系統(tǒng)中彼此比較接近 短桿菌屬隸屬于短桿菌科 Brevibacteriaceace 而棒狀桿菌屬 小桿菌屬及節(jié)桿菌屬則都隸屬于棒狀桿菌科 corynebacteriaceae 短桿菌科和棒狀桿菌科均屬于真細菌目中的革蘭氏染色陽性 無芽抱桿菌及有芽抱桿菌的一大類 二 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的菌學性質(zhì) 三 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 三 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 三 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的主要特征 總結(jié) 第二節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化 人們發(fā)現(xiàn) 谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中會發(fā)生明顯的菌體形態(tài)的變化 實踐證明 在發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)菌體形態(tài)有明顯的變化時 正是產(chǎn)谷氨酸的激增時間 但在發(fā)酵培養(yǎng)基含有過剩生物素的培養(yǎng)條件下 菌體形態(tài)則沒有明顯變化 卻呈現(xiàn)耗糖 長菌 不產(chǎn)谷氨酸的異常發(fā)酵 一 種子的菌體形態(tài) 斜面和一 二級種子培養(yǎng)在不同培養(yǎng)條件下 細胞形態(tài)基本相似 斜面培養(yǎng)的菌體較細小 一 二級種子比斜面菌體大而粗壯 革蘭氏染色深 多為短桿至棒桿狀 有的微呈彎曲狀 兩端鈍圓 無分枝 細胞排列呈單個 成對及 V 字形 有柵狀或不規(guī)則聚塊 分裂的細胞大小為0 7 0 9 1 0 3 4um 由于生物素充足 繁殖的菌體細胞均為谷氨酸非積累型細胞 二 谷氨酸發(fā)酵不同階段的菌體形態(tài) 從谷氨酸發(fā)酵中菌體形態(tài)的變化來看 大致可以分為長菌型細胞 轉(zhuǎn)移期細胞和產(chǎn)酸型細胞3種不同時期的細胞形態(tài) 三 谷氨酸發(fā)酵感染噬菌體后的菌體形態(tài) 發(fā)酵前期感染噬菌體后 菌體細胞明顯減少 細胞不規(guī)則 發(fā)圓 發(fā)胖 缺乏 字形排列 有明顯的細胞碎片 嚴重時出現(xiàn)拉絲 拉網(wǎng) 互相堆在一起 幾乎找不到完整的菌體細胞 類似蛛網(wǎng)或魚翅狀 在發(fā)酵中 后期感染噬菌體后 菌體細胞形態(tài)不規(guī)則 邊緣不整齊 有的邊緣似乎有許多毛刺狀的東西 有細胞碎片 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 1 日常菌種工作 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 育種思路 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 育種思路1 切斷或減弱支路代謝2 解除自身的反饋抑制3 增加前體物的合成4 提高細胞膜的滲透性5 強化能量代謝6 利用基因工程技術(shù)構(gòu)建谷氨酸工程菌株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 2 選育耐高滲透壓的菌株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 3 選育不分解利用谷氨酸的突變株 即選育以谷氨酸為唯一碳源菌體不長或生長微弱的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 4 選育細胞膜滲透性好的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 5 選育強化CO2固定反應(yīng)的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 6 選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 7 選育強化三羧酸循環(huán)中從檸檬酸到a 酮戊二酸代謝的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 8 選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 9 選育強化能量代謝的突變株 第三節(jié)谷氨酸生產(chǎn)菌的育種 10 選育減弱HMP途徑后段酶活性的突變株 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 一 應(yīng)用原生質(zhì)體融合新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 1 標記菌株的篩選 2 原生質(zhì)體的制備 3 原生質(zhì)體的再生 4 原生質(zhì)體的融合 5 融合子的選擇 6 實用性菌株的篩選 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 二 應(yīng)用轉(zhuǎn)化法選育谷氨酸生產(chǎn)菌 所謂轉(zhuǎn)化 是指受體細胞直接吸收了來自供體細胞的DNA片段 并將它整合到自己的基因組中 從而獲得了供體細胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象 轉(zhuǎn)化作用需要受體菌和轉(zhuǎn)化DNA 轉(zhuǎn)化既是進行細菌遺傳分析的有效工具 亦是微生物育種的有效方法 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 三 應(yīng)用轉(zhuǎn)導法選育谷氨酸生產(chǎn)菌 所謂轉(zhuǎn)導 是指通過溫和型噬菌體為媒介 將供體細腦中的DNA片段攜帶到受體細胞中 從而使受體細胞獲得了供體細胞部分遺傳性狀的現(xiàn)象 轉(zhuǎn)導作用需要三個組成部分 即供體菌 轉(zhuǎn)導噬菌體 受體菌 由于絕大多數(shù)細菌 包括谷氨酸生產(chǎn)菌在內(nèi) 都有噬菌體 所以轉(zhuǎn)導遠較轉(zhuǎn)化作用普遍 又因為轉(zhuǎn)導DNA位于噬菌體蛋白質(zhì)外殼內(nèi) 所以不會像轉(zhuǎn)化DNA那樣容易被外界的DNA分解酶所破壞 因此比較穩(wěn)定 轉(zhuǎn)導同轉(zhuǎn)化一樣 也是微生物育種的有效方法 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 四 應(yīng)用重組DNA技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 重組DNA技術(shù)也稱為基因工程 它是在分子遺傳學理論的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 它綜合了生物化學和微生物學的現(xiàn)代技術(shù)和手段在離體條件下將某種生物的基因與作為載體的DNA分子連接起來 然后轉(zhuǎn)化到某一寄主細胞中 使之進行復(fù)制并得以表達 從而使寄主菌獲得新的遺傳性狀 利用重組DNA技術(shù) 可以使編碼限速酶的基因擴增以排除生物合成途徑中的 瓶頸 從而使谷氨酸產(chǎn)量增加 因比重組DNA技術(shù)是提高谷氨酸產(chǎn)量的一種新的有效手段 第四節(jié)利用生物工程新技術(shù)選育谷氨酸生產(chǎn)菌 五 應(yīng)用固定化細胞技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)谷氨酸 固定化細胞是60年代后期發(fā)展起來的一項新技術(shù) 是通過物理的或化學的方法將細胞束縛在一定區(qū)間內(nèi)使之仍具有催化活性的固定化生物催化劑 由于它既能保持酶或微生物細胞的催化功能 又能使細胞很方便地與反應(yīng)液分離 并能進行重復(fù)使用 所以對原材料的合理利用 縮短不必要的操作時間 防止環(huán)境污染及進行現(xiàn)代化的工業(yè)生產(chǎn)部具有重要的現(xiàn)實意義 舉例 通過基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 在谷氨酸生產(chǎn)中 依其代謝途徑 把不必要的代謝途徑 經(jīng)誘變阻斷了a一酮戊二酸到琥珀酰CoA和乙醛酸兩條代謝途徑 切斷后 同時誘變出細胞滲漏型甘油缺陷B4 以便讓谷氨酸有效外漏 解除因代謝途徑改變后細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物谷氨酸過度積累而產(chǎn)生的反饋抑制 谷氨酸產(chǎn)量有一定提高 經(jīng)誘變篩選得到的營養(yǎng)缺陷型突變株B4比其出發(fā)菌株Bl提高產(chǎn)酸率18 6 和對糖的轉(zhuǎn)化率提高12 3 舉例 通過基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 舉例 通過基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 1 菌株和質(zhì)粒 舉例 通過基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 舉例 通過基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 2培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 舉例 通過基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 1 3DNA的提取與純化1 4PCR克隆pfkA基因1 5重組質(zhì)粒Ku一1的構(gòu)建及重組菌的篩選和鑒定1 6重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性1 7磷酸果糖激酶活性測定1 8糖轉(zhuǎn)化率和谷氨酸生成比較 舉例 通過基因工程構(gòu)建谷氨酸生產(chǎn)菌B44 結(jié)果 經(jīng)基因工程改造后的B44對糖的轉(zhuǎn)化率有所提高 谷氨酸產(chǎn)量有較大的提高 這主要是增大磷酸果糖激酶劑量 解除了EMP途徑中的磷酸果糖激酶的限制 以致解除了磷酸果糖激酶對已經(jīng)改造的谷氨酸整個代謝途徑的限制 故物流代謝增強 以致B44對糖的轉(zhuǎn)化率有所提高 谷氨酸產(chǎn)量有較大的提高 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 國內(nèi)谷氨酸發(fā)酵種子擴大培養(yǎng)普遍采用二級種子培養(yǎng)的流程 即 斜面菌種 一級種子培養(yǎng) 二級種子培養(yǎng) 發(fā)酵罐 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴大培養(yǎng) 1 斜面菌種的培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴大培養(yǎng) 2 一級種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴大培養(yǎng) 2 一級種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴大培養(yǎng) 3 二級種子培養(yǎng) 1 培養(yǎng)基組成 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴大培養(yǎng) 3 二級種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 一 菌種的擴大培養(yǎng) 3 二級種子培養(yǎng) 第五節(jié)菌種的擴大培養(yǎng)和種子的質(zhì)量要求 二 影響種子質(zhì)量的因素 1 培養(yǎng)基構(gòu)成 種子培養(yǎng)基要求合有豐富的氮源 足夠的生物素 少量的碳源 以利于菌體生長 如果糖分過多 菌體代謝活動旺盛 產(chǎn)生有機酸 使PH降低菌種容易衰老 2 溫度 幼齡菌對溫度變化敏感 應(yīng)避免溫度過高和波動大 3 PH值 零小時時PH不宜過高 培養(yǎng)結(jié)束PH不宜過低 PH上升后有所下降時 培養(yǎng)時間已接近結(jié)束 4 溶解氧 長菌階段對氧要求比發(fā)酵時低 溶氧水平過高 抑制長菌 5 接種量 種量過少 菌體增長緩慢 適應(yīng)期長 培養(yǎng)時間長 影響種子活力 但種量過大 在拼瓶操作中易引起污染 一般種且以1 左右為宜 6 培養(yǎng)時間 培養(yǎng)時間不宜太長 以7 8h為好 掌握對數(shù)生長期作為種子接入發(fā)酵罐 總結(jié) 谷氨酸生產(chǎn)的種子制備 制備過程 斜面菌種 一級種子培養(yǎng) 二級種子培養(yǎng) 發(fā)酵 1 斜面 AS1 299 培養(yǎng)基 蛋白胨1 牛肉膏1 氯化鈉0 5瓊脂2 pH7 0 7 2 培養(yǎng)基特點 有利于菌體的生長 原料比較精細 培養(yǎng)條件 32 生長18 24小時 生長斜面要求 生長良好 所使用斜面連續(xù)傳代不超過3次 2 一級種子 搖瓶 培養(yǎng)條件 于1000ml三角瓶中 裝液200 250ml 32 培養(yǎng)12小時 培養(yǎng)基 葡萄糖2 尿素0 5 玉米漿2