淋巴細胞亞群.docVIP

機體免疫狀態(tài)是衡量機體是否患病的重要指標，目前多采用流式細胞術來監(jiān)測機體的免疫狀態(tài)，其中最重要的指標是檢測T、B和NK淋巴細胞的水平。 T細胞主要包括T輔助細胞（Th）和T抑制細胞（Ts）細胞亞群。CD3+細胞代表外周血中總的成熟T細胞，理論上應約等于CD4+細胞和CD8+細胞的總和，但往往出現CD4+加CD8+細胞之和大于CD3+，這是因為CD4+細胞包括CD3+/CD4+細胞（真正Th細胞）和CD3-CD4+細胞（非Ts細胞），而后者包括CD3-CD8+CD16+56+細胞（一部分NK細胞）和CD3-CD8+CD16+56-（未知細胞）。由此可見，真正的TH細胞是CD3+CD4+細胞，真正Ts細胞是CD3+CD8+細胞。尤其當患者NK細胞明顯增加時，會使CD4細胞和CD8細胞的總和遠大于CD3+細胞，因此，用三色熒光標記才能分析真正的輔助性T細胞和抑制性T細胞。 首先在淋巴細胞中識別出CD3細胞，然后在CD3細胞中再區(qū)分CD4+和CD8+細胞。NK細胞的表面無T細胞和B細胞表面標志，但有CD16和CD56等標志，用CD16+56抗體能鑒定出NK細胞（一定是CD3陰性），CD3-CD16+56+細胞才是真正的NK細胞。根據是否表達CD8，又可將NK細胞分為CD3-CD8+CD16+56+細胞（所占比例小，不影響CD8比例）和CD3-CD8-CD16+56+細胞（主要成分）。 B細胞的表面標志是CD19，理論上CD3-CD19+細胞才是真正的B淋巴細胞。但CD3+CD19+細胞很少，可忽略不計，所以CD19+細胞就是B淋巴細胞。 在抗腫瘤效應中，CD4和CD8分別是T淋巴細胞的輔助誘導細胞亞群與抑制/細胞毒細胞亞群，CD4細胞的主要功能是通過其分泌的淋巴因子，增強和擴大免疫應答過程，輔助誘導其它免疫細胞如殺傷性T細胞，B細胞等共同發(fā)揮抗腫瘤作用，CD4細胞的減少，導致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫狀態(tài)監(jiān)測指標，其比例的降低與免疫系統(tǒng)損害的程度相關。 CD4降低見于惡性腫瘤、遺傳性免疫缺陷癥、艾滋病、應用免疫抑制劑者；CD8降低見于自身免疫性疾病或變態(tài)反應性疾??；CD4/CD8比值升高見于惡性腫瘤、自身免疫性疾病、變態(tài)反應、病毒感染等；CD4/CD8比值降低見于艾滋病(常小于0.5)。監(jiān)測器官移植排斥反應時，CD4/CD8比值升高預示可能發(fā)生排斥反應。淋巴細胞擔負著免疫的主要功能。淋巴細胞亞群的測定有助于了解機體免疫狀況及一些疾病的監(jiān)測。利用各種單克隆抗體與淋巴細胞表面的抗原結合，再配合多色熒光染料，通過流式細胞儀檢測分析即可以把各種不同功能的淋巴亞群區(qū)分開來，進而得到各亞群的相對比例。最常檢測的亞群包括T細胞（CD3）、B細胞（CD19）、NK細胞（CD16+56）、輔助性T細胞（CD3+CD4+）和抑制性T細胞（CD3+CD8+）等等。(1) 應用CD3/CD19區(qū)分T淋巴細胞和B淋巴細胞CD3是T細胞的特異性抗原，CD19則用來識別B細胞因此應用CD3/CD19雙標試劑即可以區(qū)分和鑒定T淋巴細胞和B淋巴細胞亞群；CD3、CD19陽性表達為獨立的陽性細胞群體。如出現雙陽性細胞均為假象。這樣就可不用同型對照來設定陰性或陽性界線。此外，此檢測還會出現雙陰性群體，這些都是NK細胞，這些細胞也提供了雙陰性群體的對照。(2) 應用CD3/CD4來鑒定CD4+T細胞首先用CD3來區(qū)分全部T細胞而CD3/CD4雙陽性細胞為真正的輔助/誘導性T細胞，這是HIV病毒感染的主要對象;CD3-/CD4+細胞群是由單核細胞組成，這些細胞相對于CD4+和T細胞來說弱表達CD4，在光散射參數的位置分布也較廣。所以CD3/CD4抗體組合能夠完全把CD4陽性輔助/誘導性T細胞區(qū)分開。另外，應用適當的雙色組合如CD4與CD29,CD4與CD45RA,也可以測定T輔助細胞的的亞群。如CD4+2H4(CD 45RA)+細胞是Ts的誘導細胞;CD4+ 4B4 (CD29)+細胞Th的誘導細胞。同理,利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+ S6F1可測定T抑制細胞的亞群。T輔助細胞還可分成Th1、Th2兩個亞群，同時標記細胞內細胞因子IFN-和IL-4，可區(qū)分Th1細胞（CD4+/IFN-+）和Th2細胞（CD4+/IL-4+）。（3）應用CD3/CD8鑒定CD8+T淋巴細胞CD8的表達不只限于細胞毒性T細胞，此抗原在部分的NK細胞上也能檢測到。所以利用CD3抗體才能把該細胞亞群分開。若采用三色測定可給出更為準確的各亞群的情況:如真正的T輔助細胞應是CD3+ CD4+CD8-,真正的T抑制細胞應是CD3+CD4- CD8+,單標CD8+細胞中不僅有T抑制細胞,還含有30%左右的NK細胞;而CD3+CD4-CD8-細胞群是T細胞,此類細胞與感染有關CD3+CD4+ CD8-細胞+CD3+CD4-CD8+細胞+CD3+CD4-CD8-細胞+CD3+CD4+CD8+細胞=CD3+細胞。(4)自然殺傷細胞（NK）的檢測CD16(FcR)表達于大多數NK細胞上，但也表達于中性粒細胞，此抗原NK細胞的表達比較弱，并在NK細胞活化時丟失；CD56表達于大多數NK細胞上，也表達于一些T淋巴細胞，與CD3聯合使用可以區(qū)分CD3+/CD56+T淋巴細胞和CD3-/CD56+NK細胞。聯合使用3種抗體最完全地鑒定所有的NK細胞。NK細胞或表達CD16，或表達CD56，但它們不表達CD3。CD16和CD56聯合使用，根據熒光強度可將NK細胞從雙陰性細胞中區(qū)分出來。這樣運用該試劑組合，NK細胞可形成獨立的群體與其它細胞相區(qū)分。圖1 流式分析細胞亞群 外周血是臨床檢驗中的重要標本。FCM分析外周白細胞的主要目的是了解各種白細胞的數目與分群情況。以下給出常用細胞亞群的正常范圍供參考,請注意同一CD中有多種克隆的McAb,同一CD中不同McAb所測出的數值不同,每個實驗室應測定自己實驗室的正常數值：表1 人外周血各細胞亞群表面抗原和流式檢測的正常參考值細胞表面抗原細胞名稱正常參考值（%）T細胞抗原CD2總T細胞62.5-89.0CD3成熟T細胞61.1-77.0CD4T輔助/誘導性細胞亞群15.8-41.6CD5T細胞（B細胞亞群）69.5-88.0CD8T細胞/細胞毒性細胞亞群18.1-29.6CD28T細胞受體共刺激分子39.5-6408CD8+/CD28+細胞毒性T細胞8.6-15.5CD8+/CD28-T抑制性細胞9.9-24.8CD3+/HLA-DR-靜止T細胞55.3-77.1B細胞抗原CD19全部B細胞7.3-18.2CD20全部B細胞7.3-18.2NK細胞抗原CD3-/CD（16+56）+NK細胞8.1-25.6造血干細胞、祖細胞CD33粒細胞前體21.3-30.4CD34多能干細胞0.1-0.5活化細胞表面抗原CD3+/HLA-DR+活化T細胞1.2-5.8CD3-/HLA-DR+活化B細胞3.0-11