Protein A親和層析柱親和層析純化人IgG1類嵌合抗體.doc

技術(shù)方法名稱: Protein A sepharose 4 fast flow親和層析柱純化人IgG1類嵌合抗體基本原理：葡萄球菌A蛋白（staphylococcal protein A）在pH值中性或堿性條件下與多種哺乳類動物IgG分子的Fc段特異結(jié)合，而在酸性條件下可以解離，可用于純化人和小鼠IgG及其亞類（IgG3除外）。sepharose 4 fast flow是高度交聯(lián)的4%的agarose衍生物，具有很好的動力學(xué)，在固相親合吸附中有很好的層析質(zhì)量，其剛性使其可理想地用于生產(chǎn)規(guī)模。Protein A sepharose 4 fast flow是protein A 與 固相基質(zhì)sepharose 4 fast flow的結(jié)合，是高特異、高穩(wěn)定性凝膠，當(dāng)凝膠裝填柱床后，能夠特異性捕獲目的抗體。用途及受限因素：1、 Protein A sepharose 4 fast flow的 IgG高載量和允許樣品通過的高流速，使其成為實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)規(guī)模制備抗體的理想凝膠。2、 Protein A sepharose 4 fast flow在純化過程中會有少量集團(tuán)脫落，如需去除用離子交換Q Sepharose HP或凝膠過濾superdex 200。3、 在不同IgG亞類之內(nèi)，甚至在相同亞類之內(nèi)，都存在著天然的多樣性，因此對于每個待純化的單抗都必須首先優(yōu)化選擇結(jié)合和洗脫系統(tǒng)。4、 層析幾批樣品之后，尤其流速明顯減慢之后，需重裝柱子。實(shí)驗(yàn)材料：1. 1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow親和層析柱生產(chǎn)廠商：pharmacia公司2. 有抗體分泌的細(xì)胞上清（本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的嵌合抗體為人IgG1類嵌合抗體，宿主細(xì)胞CHO）3. 柱體平衡液：0.1M PB緩沖液 （PH7.0）4. 抗體洗脫液：0.1mol/L檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（PH3.0）5. 1mol/L Tris堿溶液（不調(diào)PH）6. 透析液：0.01M PBS （ PH7.4）7. 20%乙醇8. 0.45m濾器9. 真空泵（本操作流程操作程序以1ml凝膠為例）實(shí)驗(yàn)設(shè)計：1 樣品處理： 取一定體積的有抗體分泌的細(xì)胞培養(yǎng)上清。（根據(jù)1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow親和層析柱能有效結(jié)合約14mg的抗體，結(jié)合待純化上清中抗體含量，計算出最大純化上清的體積） 將細(xì)胞上清4離心10000rpm20min，去除細(xì)胞碎片。 細(xì)胞上清經(jīng)0.45m濾膜抽濾脫氣，除去未沉降的蛋白等一些雜質(zhì)，留樣1ml，記錄樣品體積。 用10mM的NaOH調(diào)節(jié)上清的pH值至7.0左右。2 平衡柱子：以0.1M的PB（PH7.0）緩沖液平衡1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow親和層析柱，流速1ml/min，體積20ml ，充分去除乙醇和雜質(zhì)，平衡至OD28050ml ，洗滌至OD2800.01，保留液體待測。5 洗脫：以0.1M的檸檬酸（PH3.0）緩沖液洗脫上樣后的1ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow親和層析柱，流速1ml/min,體積不限，分管收集，同時用1M Tris調(diào)其PH至7.0左右，洗脫至OD2800.01，保留液體待測。6 純化后抗體處理： 用分光光度計測OD280，初步計算產(chǎn)量。 將該樣品置于透析袋中，在PBS（PH7.4）中透析，換液23次，6-8h/次。 將樣品用無菌的0.2M的濾器過濾純化的抗體，然后分裝于1.5ml無菌塑料管中，20儲存?zhèn)溆谩? 再生:再以0.1M的檸檬酸（PH3.0）緩沖液再生洗脫后的Protein A Sepharose 4 Fast Flow親和層析柱，流速1ml/min，體積3-5ml。8 保存：以含20%乙醇的PBS（PH7.4）平衡再生后的洗脫后的Protein A Sepharose 4 Fast Flow親和層析柱，流速1ml/min，體積30-50ml。關(guān)閉柱子，整體浸泡在含20%乙醇的PBS（PH7.4）中，4保存。注意事項(xiàng)：1 本實(shí)驗(yàn)全過程應(yīng)盡量在4下操作。2 細(xì)胞上清必須高速離心并過濾，防止污染柱料。3 防止柱子流干、凍冰。4 上樣液置于4下上樣，上樣一段時間后流速將下降，應(yīng)盡量排除柱內(nèi)氣體。5 洗脫時，換洗脫緩沖液應(yīng)注意排除凝膠表面前步殘留液體體積，防止影響洗脫效果。6 流穿液和每步洗柱液應(yīng)保留，待實(shí)驗(yàn)完畢后統(tǒng)一處理。結(jié)果觀查及分析的原則采用分光光度計測OD280，按1mg=1.35OD280計算抗體量。同時結(jié)合夾心ELISA檢測上樣前與上樣后嵌合抗體含量的變