測量蛋白質(zhì)三種方法測定原理.doc

測定蛋白質(zhì)含量的三種方法原理院系：xxx專業(yè)：xxx姓名：xxx學(xué)號：xxx測量蛋白質(zhì)三種方法測定原理【摘要】了解測量蛋白質(zhì)三種測定方法的基本原理和優(yōu)缺點(diǎn)。三種方法為考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法），F(xiàn)olin酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法?！娟P(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)含量測定 考馬斯亮藍(lán)法 Folin酚試劑法 紫外吸收法蛋白質(zhì)含量測定法，是生物化學(xué)研究中最常用、最基本的分析方法之一目前常用的有兩種古老的經(jīng)典方法，即Folin酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。另外還有一種近十年才普遍使用起來的新的測定法，即考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）。其中Bradford法和Lowry法靈敏度最高，比紫外吸收法靈敏1020倍。每種測定法都不是完美無缺的，都有其優(yōu)缺點(diǎn)。在選擇方法時(shí)應(yīng)考慮：實(shí)驗(yàn)對測定所要求的靈敏度和精確度；蛋白質(zhì)的性質(zhì)；溶液中存在的干擾物質(zhì)；測定所要花費(fèi)的時(shí)間。簡單列表為：方 法 靈敏度 優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)紫外吸收法50100mg 快速簡便無損樣品靈敏度低干擾物較多考馬斯亮藍(lán)法（Bradford）法15ug 靈敏、簡便、快速不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差 Lowry法20250ug 靈敏度高干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)考馬斯亮藍(lán)法雙縮脲法（Biuret法）和Folin酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點(diǎn)和許多限制，促使科學(xué)家們?nèi)ふ腋玫牡鞍踪|(zhì)溶液測定的方法。1976年由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。這種蛋白質(zhì)測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。這一方法是目前靈敏度最高的蛋白質(zhì)測定法。它是一種蛋白定量法（一） 實(shí)驗(yàn)原理考馬斯亮藍(lán)G-250（Coomassie G-250）是一種甲基取代的三苯基甲烷，分子中磺酸基的藍(lán)色染料，在465nm處有最大吸收值。考馬斯亮藍(lán)G-250能與蛋白質(zhì)通過范得華相互作用形成蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物藍(lán)色溶液，引起該染料的最大吸收max的位置發(fā)生紅移，在595nm處有最大吸收值。由于蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物在595nm處的光吸收遠(yuǎn)高于考馬斯亮藍(lán)在465nm處的光吸收，因此，可大大地提高蛋白質(zhì)的測定靈敏度。蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)復(fù)合物溶液顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。利用溶液顏色的差異進(jìn)行比色測定，適合于蛋白質(zhì)類的定量分析，尤其適合于稀有蛋白質(zhì)的微量分析。（二）Bradford法的突出優(yōu)點(diǎn)是：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達(dá)1mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費(fèi)時(shí)和嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。（三）此法的缺點(diǎn)是：（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時(shí)有較大的偏差，在制作 標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進(jìn)行計(jì)算，而只能用標(biāo)準(zhǔn)曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。Folin-酚試劑法Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步 雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中，雙縮脲（H2NOCNHCONH2）能與Cu2+作用,形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，這個(gè)反應(yīng)叫做雙縮脲反應(yīng)。由于蛋白質(zhì)分子中含有與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似的多個(gè)肽鍵, 因此有雙縮脲反應(yīng)。即在堿性溶液中，蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的Cu2+作用生成紫紅色的蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物。第二步 Folin-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物）。由于蛋白質(zhì)中含有帶酚羥基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此顯色反應(yīng)。即蛋白質(zhì)- Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比色即可求出樣品中蛋白質(zhì)的含量。另外，可以根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出待測樣品中蛋白質(zhì)的含量。紫外吸收法 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280nm附近。最大吸收波長處，吸光度與蛋白質(zhì)溶液濃度的關(guān)系服從朗伯爾比爾定律： A=abc“A”為溶液的吸光度值，“b”為石英比色池的厚度，“c”為蛋白質(zhì)溶液的濃度。 紫外-可見吸收光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是研究分子吸收190nm750nm波長范圍內(nèi)的吸收光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸收為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸收光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價(jià)電子躍遷的結(jié)果，其吸收光譜為分子光譜，是帶光譜。紫外-可見分光光度法所采用的儀器稱為分光光度計(jì)，它的主要部件有五個(gè)部分組成，如下所示：由光源發(fā)出的復(fù)合光經(jīng)過單色器分光后即可獲得任一所需波長的平行單色光,該單色光通過樣品池對樣品溶液吸收后，通過光照到光電管或光電倍增管等檢測器上產(chǎn)生光電流，產(chǎn)生的光電流由信號顯示器直接讀出吸光度A?？梢姽鈪^(qū)采用鎢燈光源、玻璃吸收池;紫外光區(qū)采用氘燈光源、石英吸收池。本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。由于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質(zhì)具有吸收紫外線的性質(zhì)，吸收高峰在280nm波長處。在此波長范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值（A280）與其含量呈正比關(guān)系，可用作定量測定。利用紫外線吸收法測定蛋白質(zhì)含量的優(yōu)點(diǎn)是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。因此，在蛋白質(zhì)和酶的生化制備中（特別是在柱層析分離中）廣泛應(yīng)用。此法的缺點(diǎn)是：（1）對于測定那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；（2）若樣品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外線的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾