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吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 提 要 A e r o p y r u m p e r n i x K1 是 1 9 9 3 年從日本海岸火山口分離的一 種超嗜熱古細(xì)菌 它最適生長溫度為 9 5 并能產(chǎn)生多種嗜熱酶 近年來 隨著嗜熱酶相繼得到開發(fā) 使其在許多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作 用 嗜熱酶不僅具有化學(xué)催化劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn) 而且穩(wěn)定性極好 可以克服中溫酶及低溫酶在應(yīng)用中常常出現(xiàn)的生物學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定 的現(xiàn)象 從而可用于催化很多高溫化學(xué)反應(yīng) 這將極大地促進(jìn)生物 技術(shù)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 從而帶動(dòng)技術(shù)水平和生活質(zhì)量的提高 目前 超 嗜熱古細(xì)菌嗜熱酶的研究還處于初期階段 其中既具有磷脂酶 A2 活力又具有酯酶活力的嗜熱酶 A P E 2 3 2 5 的研究具有重要意義 磷脂酶 A2 p h o s p h o l i p a s e A2 E C 3 1 1 4 簡稱 P L A2 具有 很多生物學(xué)功能 參與許多生理活動(dòng) 近年來發(fā)現(xiàn)它還具有廣泛的 心血管藥理效應(yīng) 從而引起人們新的研究興趣 正是 P L A2這種相對 簡單的化學(xué)結(jié)構(gòu)和復(fù)雜的藥理生理功能之間的反差 使之成為研究 脂質(zhì)代謝 脂蛋白代謝 生物膜磷脂結(jié)構(gòu)以及脂 蛋白相互作用的 結(jié)構(gòu)和功能的重要工具酶 近年來 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā) 展 國外對酯酶基因的克隆研究很活躍 促進(jìn)了酯酶的生物特性及 相關(guān)功能的研究 而國內(nèi)這方面的研究則起步較晚 基于古細(xì)菌的進(jìn)化位置和嗜熱磷脂酶 A2和酯酶的重要作用 我 們開展了對嗜熱酶 A P E 2 3 2 5 的性質(zhì) 結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究 第一章 前言 1 古細(xì)菌 1 9 7 7年 W o e s e等人根據(jù) 2 0 0多種細(xì)菌和真核生物的核糖體小 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 達(dá) 這樣就能在溫和的培養(yǎng)條件下得到大量的嗜熱酶 目前 一些 從嗜熱菌中獲得的基因已在大腸桿菌等中溫宿主中得到了成功地 表達(dá) 7 9 隨著 D N A 測序技術(shù)的提高 許多嗜熱菌的基因組已經(jīng)被解析 通過與中溫菌的已知基因序列對比 已推測得到許多酶蛋白基因序 列 但酶的特性還需要在基因表達(dá)后得到進(jìn)一步的表征 在古核菌 基因組中 還有大約 4 0 的未知功能基因 對這些基因所表征蛋白 的研究和開發(fā) 將為工業(yè)過程提供新的豐富的酶資源 1 0 1 2 利用嗜熱酶作為生物催化劑有如下的優(yōu)點(diǎn) 1 備成本低 因?yàn)槭葻崦傅姆€(wěn)定性高 所以可以在室溫下分 離提純和包裝運(yùn)輸 并且能長久地保持活性 2 加快了動(dòng)力學(xué)反應(yīng) 隨著反應(yīng)溫度的提高 分子運(yùn)動(dòng)速度 加快 酶催化能力加強(qiáng) 3 對反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)低 因而減少了能量消耗 由于嗜熱酶有耐高溫的特性 所以生產(chǎn)中不需要復(fù)雜的冷卻裝置 一方面節(jié)省了開支 另一方面也降低了冷卻過程對環(huán)境所造成的污 染 4 提高了產(chǎn)物的純度 在嗜熱酶催化反應(yīng)條件下 超過 7 0 很少有雜菌生存 從而減少了細(xì)菌代謝物對產(chǎn)物的污染 由于嗜熱酶的高溫反應(yīng)活性 以及對有機(jī)溶劑 去污劑和變性劑的 較強(qiáng)抗性 使它在食品 醫(yī)藥 制革 石油開采及廢物處理等方面 都有廣泛的應(yīng)用潛力 3 酯酶簡介 酯酶 E s t e r a s e s E C 3 1 1 1 是一類廣泛分布于組織與器官 的絲氨酸水解酶類 能水解許多含有羧酯鍵 硫酯鍵 酰胺鍵的內(nèi) 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 源性及外源性物質(zhì) 其主要功能是參與脂質(zhì)代謝 信號(hào)傳導(dǎo)及維持 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 脂酶 A2 一種是鈣離子不依賴性磷脂酶 A2 i P L A2 2 0 按照 i P L A2 的生化特性可將其分為三類 溶酶體性或酸性 i P L A2 刷狀緣膜性 i P L A2 細(xì)胞內(nèi) i P L A2 1 5 2 1 2 5 i P L A2主要存在于腦 肺 心和肝組織 以及巨噬細(xì)胞中 只有少數(shù)幾種 i P L A2已被純化出來 但都還未完 成氨基酸序列分析 鈣離子依賴型磷脂酶 A2根據(jù)分子量和細(xì)胞分布 又分為兩類 一類是低分子量 1 0 1 4 k D a 的分泌型磷脂酶 A2 s P L A2 一類是與結(jié)構(gòu)有關(guān)的高分子量 8 5 k D a 的細(xì)胞內(nèi)型磷脂 酶 A2 c P L A2 2 6 來自細(xì)胞液和血小板的 s P L A2涉及到炎癥反應(yīng)的 發(fā)病機(jī)制 最近研究表明 s P L A2在炎癥過程中有雙重作用 1 與磷脂酶有關(guān)的防護(hù) 消化功能 需要鈣離子 主要作用于原核細(xì) 胞 2 通過結(jié)合原生質(zhì)膜受體的細(xì)胞信號(hào)功能 主要作用于真核 細(xì)胞 2 7 2 8 而 c P L A2主要在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮作用 2 9 3 1 鈣離子依 賴型多數(shù)存在于胰腺和蜂毒液以及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑液或一些細(xì) 胞株中 而且具有特異的酶催化活性 而 i P L A在組織中的含量極 低 酶活性也缺乏特異性 3 2 目前 國內(nèi) P L A2的研究絕大部分是蛇 P L A2的研究 而且這些 酶大多數(shù)屬于中溫酶 3 3 4 0 國外 蛇毒 P L A2的克隆與表達(dá) 晶體結(jié) 構(gòu)模擬等都已有詳細(xì)報(bào)道 蜂毒 P L A2的 D N A 重組及結(jié)構(gòu)也進(jìn)行了初 步研究 4 1 4 5 隨著越來越多地 s P L A2類型被發(fā)現(xiàn) 研究者已經(jīng)進(jìn)行 了 s P L A2的受體研究 以及不僅僅只限于催化功能研究 4 6 隨著克 隆和酶系性質(zhì)的研究 開始對 c P L A2進(jìn)行功能性研究 如 c P L A2選 擇性地從天然膜中釋放花生四烯酸 與激素偶聯(lián)等作用 對 i P L A2 已進(jìn)行氨基酸序列分析和調(diào)控機(jī)制的研究 而嗜熱 P L A2 特別是古 細(xì)菌嗜熱 P L A2的研究還處于初始階段 到現(xiàn)在為止 只在 P y r o c o c c u s h o r i k o s h i i 中發(fā)現(xiàn)了嗜熱 P L A2的活力 4 7 但是由于其 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性 還沒有成功地構(gòu)建表達(dá)嗜熱 P L A2的工程菌 基 于古細(xì)菌的進(jìn)化位置和嗜熱 P L A2的重要作用 使研究人員對嗜熱 P L A2格外關(guān)注 5 嗜熱 P L A2的應(yīng)用前景 P L A2是一種水解天然脂類的水解酶 它所產(chǎn)生的兩種產(chǎn)物都是 高強(qiáng)度的膜活性因子 他們相互作用于雙分子脂膜結(jié)構(gòu) 使紅血球 膜破裂 紅細(xì)胞溶解 析出血紅蛋白 產(chǎn)生溶血效應(yīng) 所以 P L A2 被稱為間接溶血毒 而且 P L A2具有其他重要的生理意義 如作為神 經(jīng)毒素 肌肉毒素和心臟毒素 與炎癥有關(guān) 對 M A P K 有絲分裂 原激活的蛋白激酶 的活化作用 抗微生物活性 在組織損傷時(shí)出 現(xiàn) 脫粒作用 與細(xì)胞有絲分裂有關(guān) 4 8 4 9 所以它在醫(yī)藥 化工 農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景 1 脫膠工序上的應(yīng)用 在油脂深加工中 一道重要的工序就是脫膠 脫膠工序的目的 是除去毛油中的膠體雜質(zhì) 提高油脂質(zhì)量 為后道加工工序打好基 礎(chǔ) 隨著物理精煉技術(shù)的推廣應(yīng)用 脫膠技術(shù)顯得尤其重要 可以 說 脫膠效果的好壞直接影響蒸餾脫酸的產(chǎn)品質(zhì)量 膠質(zhì)中最主要 的是磷脂 其中又分為可水化磷脂和非水化磷脂 可水化磷脂是比 較容易除掉的 而非水化磷脂用直接水化法難以除去 新脫膠法都 是針對這一點(diǎn) 用各種方式解決這一難題 目前 我國所生產(chǎn)的高烹油或色拉油 其主要處理步驟為脫膠 脫酸 脫色和脫臭 當(dāng)采用傳統(tǒng)的方法生產(chǎn)食用油時(shí)如用堿煉的方 法脫酸 膠質(zhì)很容易形成穩(wěn)定的乳化泡狀物 結(jié)果造成不必要的浪 費(fèi) 在植物油中所存在的膠質(zhì)主要由磷脂組成 磷脂的含量和其他 組成由植物油的種類和萃取條件所決定 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 第二章 A P E 2 3 2 5的工程菌構(gòu)建和表達(dá) 一 材料和方法 1 主要儀器 1 H Z Q X 振蕩培養(yǎng)箱 黑龍江省東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司 2 J 2 2 1 M 高速冷凍離心機(jī) 美國 B a c k m a n 公司 3 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 1 4 4 2 M U L T I W A V E L E I V G T H F L U O R O I M A G E R W A L L A C A R T H U R 公司 4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)器 B i o m e t r a 公司 5 無菌操作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠 6 D Y Y 2 型穩(wěn)壓溫流電泳儀 北京市六一儀器廠 2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶 T4 D N A 連接酶 T a q D N A 聚合酶和 D N A 分子質(zhì) 量標(biāo)準(zhǔn)等購于 T a K a R a B i o T E C H C o L t d 寶泰克生物科技公司 凝膠回收試劑盒 質(zhì)粒提取試劑盒購于 Q I A G E N 公司 P C R 引物合成和 D N A 測序由北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中心完成 其他藥品和試劑均為分析純 3 試劑配制 T E 緩沖液 p H 8 0 含 1 m m o l L E D T A p H 8 0 的 1 0 m m o l L T r i s C l p H 8 0 緩沖液 S T E緩沖液 含 1 m m o l L E D T A p H 8 0 和 0 1 m o l L N a C l的 1 0 m m o l L T r i s C l p H 8 0 緩沖液 T A E 緩沖液 0 0 4 m o l L T r i s 乙酸 0 0 0 1 m o l L E D T A 用于制備質(zhì)粒的堿裂解緩沖液 溶液 5 0 m m o l L 葡萄糖 2 5 m m o l L T r i s C l p H 8 0 1 0 m m o l L E D T A 在 6 8 9 5 1 0 4 P a 高壓下蒸氣滅菌 1 5 分鐘后 保存于 4 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 溶液 0 2 m o l L N a O H 從 2 m o l L 貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)稀釋 1 S D S 從 1 0 的貯存液中現(xiàn)用現(xiàn)稀釋 溶液 5 m o l L 乙酸鉀 6 0 m l 冰乙酸 1 1 5 m l 水 2 8 5 m l 所配 溶液中鉀的濃度為 3 m o l L 乙酸根的濃度為 5 m o l L 4 培養(yǎng)基成分 1 2 Y T 液體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 2 2 Y T 固體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 瓊脂粉 2 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 3 無菌氨芐青霉素溶液 1 0 0 m g 氨芐青霉素溶于 1 m l 無菌水 4 無菌 I P T G 溶液的配制 0 2 3 8 g I P T G粉末 定溶于 1 0 m l無菌水 用 0 4 5 m濾器過 濾除菌 二 實(shí)驗(yàn)方法 1 提取 A e r o p y r u m p e r n i x K1染色體基因組 1 取 1 5 m l 的 A e r o p y r u m p e r n i x K1培養(yǎng)物于 1 0 0 0 0 r p m 離心 分鐘 倒盡上清液 用 2 0 0 l 溶液 重懸沉淀 2 加入 5 0 l 的 5 0 m g m l 溶菌酶 在 4 下消化 小時(shí) 3 加入 1 2 體積的 2 的 S D S 溶液反應(yīng) 1 0 分鐘 4 加入等體積的酚 氯仿 異戊醇 混勻 離心 5分鐘 將上清 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 應(yīng)用鼎國技術(shù)公司 D N A 片段快速回收試劑盒 操作方法見北京鼎國技術(shù)公司的產(chǎn)品使用說明書 4 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化 1 將甘油保藏的菌種 2 0 0 u l 接種于裝有 1 0 m l L B 培養(yǎng)液的 5 0 m l 試管中于 3 7 震蕩 2 5 0 r p m m i n 培養(yǎng)過夜 2 向兩個(gè)內(nèi)裝 2 0 0 m l L B 培養(yǎng)液的 1 L三角瓶中各加入 4 m l 過夜 培養(yǎng)細(xì)胞 于 3 7 下震蕩培養(yǎng)至光密度 O D6 0 0 值介于 0 5 0 6 之 間 約需 1 2 h 3 將每份細(xì)胞培養(yǎng)物分別倒入一個(gè)預(yù)先冰浴的無菌 2 5 0 m l離心 瓶并置于冰上保持 2 0 m i n 于 4 下離心 1 0 m i n 8 0 0 0 r p m m i n 1 0 0 0 0 g 棄上清 4 將每份沉淀輕緩地懸于 1 0 0 m l 冰冷的 0 1 m o l L M g C l2 p H 7 2 溶液中 按上述方法再次離心 5 去上清 并將每一沉淀輕緩地懸浮于 2 0 m l 冰冷的含 2 0 甘油 的 0 1 m o l L C a C l2 p H 7 2 溶液中 6 每管 1 m l分裝于 4 0個(gè) 1 5 m l E p p e n d o r f管中 8 0 冷凍貯 存?zhèn)溆?5 質(zhì)粒 D N A 的小量制備 堿裂解法 方法一 1 細(xì)菌培養(yǎng)物倒入 1 5 m l 無菌微量離心管中 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分鐘離 心數(shù)秒 倒盡培養(yǎng)液 2 加 4 0 0 l S T E 溶液重懸 洗滌沉淀后 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分鐘離心 3 0 秒 倒盡上清 3 將細(xì)菌沉淀重懸于 9 0 l用冰預(yù)冷的溶液 中 加 1 0 l溶 菌酶混勻 4 放置 1 小時(shí) 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 4 加入 2 0 0 l 溶液 蓋緊管口 快速顛倒離心管數(shù)次 確保 離心管的整個(gè)內(nèi)表面均與溶液 接觸 將離心管放置于冰水浴 5 分 鐘 5 加入1 5 0 l 預(yù)冷的溶液 溫和顛倒 4 6 次 冰浴3 5 分鐘 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分離心 5 分鐘 上清移至另一無菌離心管 6 加等體積的酚 氯仿 異戊醇 振蕩混勻 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分離心 上清移至另一無菌離心管 7 用 2 倍體積預(yù)冷乙醇沉淀 D N A 1 2 0 0 0 轉(zhuǎn) 分離心 5 分鐘 沉淀 用 7 0 乙醇洗兩次 干后用 T E 溶解備用 方法二 1 應(yīng)用鼎國技術(shù)公司質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?2 操作方法見北京鼎國技術(shù)公司的產(chǎn)品使用說明書 注 在加 入 2 0 0 l B 液后先加入 1 0 l 溶菌酶 4 消化 1 小時(shí) 再加 R n a s e A 操作 其余同說明書 6 體外重組 1 P C R 純化產(chǎn)物的雙酶切 在 1 5 m l E p p e r d o r f 管中 加入 B u f f e r 1 0 K 2 l B a m H 1 l N d e 1 l P C R 純化產(chǎn)物 1 2 l D d H2O 4 l 2 0 l 在 3 7 保溫 1 小時(shí) 2 質(zhì)粒的雙酶切 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 用具有高保真的P C R 擴(kuò)增用的D N A 聚合酶 以古細(xì)菌A e r o p y r u m p e r n i x K1染色體基因組為模板進(jìn)行 A P E 2 3 2 5的擴(kuò)增 P C R反應(yīng)條 件 9 4 2 m i n 對模板進(jìn)行變性 在 9 4 1 m i n 5 5 1 5 m i n 7 2 2 m i n 3 5 個(gè)循環(huán) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 2 瓊脂糖電泳分析 于 4 7 0 b p 左右處出現(xiàn)一條特異帶 大小與預(yù)期 4 7 4 b p 相符 圖 2 1 Fig 2 1 P C R a m p l i c a t i o n o f A P E 2 3 2 5 g e n e A P C R p r o d u c t o f A P E 2 3 2 5 g e n e M D L 2 0 0 0 M a r k e r 將預(yù)期大小 4 7 4 b p 的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒回收后 與 p E T 1 5 b 載體連接 轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 B L P 涂布于氨芐 2 Y T 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 Fig 2 2 R e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t e d o f t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d p E T 1 5 b A P E 2 3 2 5 A D L 2 0 0 0 M a r k e r B C o l o n y o f p E T 1 5 b A P E 2 3 2 5 d i g e s t e d w i t h N d e B a m H C H i n d M a r k e r 選取酶切鑒定正確的克隆質(zhì)粒送交北京鼎國生物技術(shù)發(fā)展中 心進(jìn)行序列測定 結(jié)果表明 克隆的 A P E 2 3 2 5 基因序列與 G e n e B a n k 中已公布的序列完全一致 測序資料略 2 1 2 S D S P A G E AM 97400 66200 43000 31000 20100 14400 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 一 材料和方法 主要儀器及試劑 1 U V 2 5 0 紫外可見分光光度計(jì)購于日本島津公司 2 胰化蛋白胨 酵母抽提液購于英國 O X O I D 公司 3 T r i s堿 異丙基硫代 D 半乳糖苷 I P T G 購于美國 B e b c o I n d u s t r i e s C o r p 公司 4 氨芐青霉素 丙烯酰胺 N N 亞甲雙丙烯酰胺 N N N N 四甲基乙二胺 十二烷基硫酸納購于美國 S i g m a 公司 5 S D S P A G E M o l e c u l a r W e i g h t M a r k e r s f o r P r o t e i n s 低 分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量 1 4 4 0 0 9 7 4 0 0 購于中科院上海生物化 學(xué)研究所 6 鎳親和柱購于德國 N o v a g e n 公司 7 P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1 軟件購于 P e r k i n E l m e r L i f e S c i e n c e s 公司 2 工程菌來源 本室構(gòu)建的以 p E T 1 5 b 為載體 大腸桿菌 B L P 為宿主高效表達(dá) 體系的產(chǎn)嗜熱磷脂酶 A2的工程菌 p E T 1 5 b含有七個(gè)組氨酸尾巴和 凝血酶切位點(diǎn) 簡化了酶表達(dá)后的重組酶純化流程 3 培養(yǎng)基成分 1 2 Y T液體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 2 2 Y T固體培養(yǎng)基 胰化蛋白胨 1 6 酵母抽提液 1 N a C l 0 5 瓊脂粉 2 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 1 N N a O H調(diào)節(jié) p H值至 7 0 1 5 l b f i n 2 1 0 3 4 1 0 5 P a 滅菌 2 0 分鐘 3 無菌氨芐青霉素溶液 1 0 0 m g 氨芐青霉素溶于 1 m l 無菌水 4 無菌 I P T G 溶液的配制 0 2 3 8 g I P T G 粉末 定溶于 1 0 m l 無菌水 用 0 4 5 m 濾器過濾 除菌 4 親和層析溶液 1 8 x B i n d i n g B u f f e r 4 0 M 咪唑 4 M N a C l 1 6 0 m M T r i s H C l p H 7 9 2 4 x E l u t e B u f f e r 4 M 咪唑 2 M N a C l 8 0 m M T r i s H C l p H 7 9 3 8 x C h a r g e B u f f e r 4 0 0 m M N i2S O 4 4 4 x S t r i p B u f f e r 2 M N a C l 8 0 m M T r i s H C l p H 7 9 4 0 0 m M E D T A 二 實(shí)驗(yàn)方法 1 A P E 2 3 2 5 工程菌的復(fù)壯及種子培養(yǎng) 涂布保存于 1 0 甘油管的種子液于固體平板上進(jìn)行復(fù)壯 挑 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 取一環(huán)新鮮的復(fù)壯后的工程菌 接入 2 m l 液體種子培養(yǎng)基中 3 7 1 2 0 r p m m i n 條件下 空氣搖床培養(yǎng) 1 2小時(shí) 作為初步放大的 種子液 2 工程菌發(fā)酵的初步放大 將 2 m l 種 子 液 注 入 到 2 0 0 m l 的液體發(fā)酵液中 3 7 1 2 0 r p m m i n 條件下 空氣搖床培養(yǎng) 1 2 小時(shí) 作為大批培養(yǎng)的種子 液 3 工程菌大批發(fā)酵及目的蛋白的誘導(dǎo) 將初步放大的種子液以 1 的比例接入 6 L的培養(yǎng)液中 3 7 1 2 0 r p m m i n 條件下空氣搖床培養(yǎng) 待菌體生長到對數(shù)期時(shí) O D 0 6 1 加入1 0 0 m M 的 I P T G的終濃度達(dá)到 1 m M 并降低 搖床的溫度為 2 5 對菌體進(jìn)行誘導(dǎo)使其產(chǎn)生大量的目的蛋白 同時(shí)避免產(chǎn)生酶的包函體 培養(yǎng) 1 0 1 2 小時(shí)后收獲菌體 4 A P E 2 3 2 5 的純化流程圖 1 粗酶液的獲得 工程菌培養(yǎng)液 離心 6 0 0 0 r p m 2 0 分鐘 稱濕重 棄去上清 將菌體于 3 0 冷凍 1 小時(shí) 溶菌體于 b i n d i n g b u f f e r 中 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 超聲破碎 1 0 分鐘 8 5 水浴 3 0 分鐘加熱變性其他菌體蛋白及激活目的蛋白 1 2 0 0 0 r p m 離心 2 0 m i n 收集上清得粗酶液 檢測蛋白濃度及粗酶活力 2 親和柱層析 3 m l 鎳親和柱 N i C h e l a t i n g C o l u m n 加入去離子水至柱頂端 自然洗脫后用 5 倍體積的 1 C h a r g e b u f f e r 自然洗脫 再加入去離 子水至柱頂端自然洗脫 后用 3 倍柱體積 1 B i n d i n g b u f f e r自然流 干 再將粗酶液上柱 待自然流干后用 1 1 2 倍柱體積的 B i n d i n g b u f f e r自然洗脫 最后用 5 倍柱體積的 1 W a s h b u f f e r 洗脫目的蛋 白 用 1 B i n d i n g b u f f e r 透析蛋白溶液除去咪唑 用聚乙二醇包埋 濃縮目的蛋白 電泳檢測純度 5 S D S P A G E S D S P A G E 在 P h a m a c i a E l e c t r o p h o r e i s E P S 5 0 0 4 0 0 型電泳儀 上進(jìn)行 1 凝膠的配制 如表 3 1 所示 2 2 X 凝膠加樣緩沖液的配制 5 0 m m o l L T r i s C l p H 6 8 1 0 0 m m o l L 二硫蘇糖醇 D T T 2 S D S 電泳級(jí) 0 1 溴酚藍(lán) 1 0 甘油 3 T r i s 甘氨酸電泳緩沖液的配制 2 5 m m o l L T r i s 2 5 0 m m o l L 甘氨酸 p H 8 3 0 1 S D S 4 染色液的配制 配制 9 0 m l乙醇 水 1 1 V V 和 1 0 m l冰乙酸的混合液 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 振搖均勻 2 6 0 0 r p m 4 離心 1 0 分鐘 收集 2 5 m l 上清液 氮?dú)飧稍?溶于 1 5 0 l 甲醇 氯仿 1 1 v v 3 薄層層析 取 1 0 l 樣品點(diǎn)在薄板上 自然干燥 然后用氯仿 甲醇 水 3 5 6 5 4 v v v 作為展層劑 分離 N B D P C和 N B D a c i d 2 酯酶活力測定方法 6 1 按表 3 2 以 1 0 m m o l L 對硝基苯丙酸酯作為底物 取 9 4 0 l 經(jīng) 9 0 保溫的 p H 值為 8 0 的 5 0 m m o l L T r i s H C l 的緩沖液 加入 4 0 l純化的 A P E 2 3 2 5 再加入 2 0 l底物測對硝基苯酚在 4 2 0 n m O D 值隨時(shí)間的變化曲線 T a b l e 3 2 反應(yīng)步驟 空白 樣品 加入保溫的 p H 8 0 T r i s H C l緩沖液 9 8 0 l 9 6 0 l 加入對硝基苯丙酸酯 2 0 l 2 0 l 加入酶液 4 0 l 總體積 1 m l 1 m l 活力計(jì)算方法 活力單位 m g O D4 2 0 0 0 1 6 V V E 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 O D 4 2 0 每分鐘 O D4 2 0 的變化 V 反應(yīng)體系的總體積 m l VE 酶在反應(yīng)體系中的體積 E 酶濃度 m g m l 4 2 0 1 0 0 1 6 M 3 A P E 2 3 2 5 活力單位定義 在上述反應(yīng)條件下 每分鐘催化 1 微摩爾對硝基苯丙酸酯所需 的酶量代表為一個(gè)活力單位 U 7 蛋白質(zhì)濃度的測定 按 B r a d f o r d 方法測定蛋白含量 用牛血清白蛋白 B S A 做標(biāo) 準(zhǔn)曲線 6 2 考馬斯亮蘭法 以牛血清白蛋白配置標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 1 m g m l 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 測定目的蛋白含量 T a b l e 3 3 B i n d i n g b u f f e r 緩沖液 1 0 0 l 9 5 l 9 0 l 8 0 l 7 0 l 6 0 l 5 0 l 4 0 l 考馬斯 亮蘭溶 液 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 5 m l 標(biāo)準(zhǔn)蛋 白溶液 5 l 1 0 l 2 0 l 3 0 l 4 0 l 5 0 l 6 0 l 1 考馬斯亮蘭溶液配制 考馬斯亮藍(lán) G 2 5 0 1 0 0 m g 溶于 5 0 m l 9 5 乙醇中 加入 1 0 0 m l 8 5 磷酸 用蒸餾水稀釋至 1 0 0 0 m l 濾紙過濾 最終試劑中含 0 0 1 W V 考馬斯亮藍(lán) G 2 5 0 4 7 W V 乙醇 8 5 W V 磷酸 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 如表 3 3 所示 三 結(jié)果與討論 1 酶純化活力回收情況 由于表達(dá)產(chǎn)物帶有 H i s t a g 標(biāo)記 所以易于通過 N i 鰲合柱獲 得純化的 A P E 2 3 2 5蛋白 同時(shí)由純化回收率及純化倍數(shù)可知 熱 變性與 N i 親和柱層析均為非常有效的純化目的蛋白的方式 表 3 4 將酶切鑒定的工程菌經(jīng) I P T G 誘導(dǎo)后 在 S D S P A G E 電泳中出 現(xiàn)一條明顯的蛋白表達(dá)帶 其分子量約為 1 8 0 0 0 D a 左右 圖 3 1 與預(yù)期值 1 7 8 7 1 D a A P E 2 3 2 5 七個(gè)組氨酸尾巴和凝血酶切位點(diǎn)基 本相符 用 P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1一維圖像分析軟件可以得出 其精確分子量為 1 8 2 8 6 D a 其預(yù)期值相符 如圖 3 2 所示 T a b l e 3 4 P u r i f i c a t i o n o f A P E 2 3 2 5 提純步驟 總活力 U 總 蛋 白 量 m g 比活力 U m g蛋 白 回收率 提純倍數(shù) 凍融后的 粗酶液 2 1 0 3 1 0 8 7 1 9 3 1 0 0 1 鎳親和柱 1 6 3 3 1 3 6 1 1 1 9 9 7 8 3 6 6 2 1 6 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 化性質(zhì) 為深入探討酶的特性 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 必須排除其它因 素對酶活性的干擾 使酶從產(chǎn)生的環(huán)境中分離提取出來 所獲得的 酶純度越高 其性質(zhì)與結(jié)構(gòu)的研究就越準(zhǔn)確 就更利于進(jìn)行理論應(yīng) 用的研究 本章研究了工程菌重組酶 A P E 2 3 2 5 的純化 通過有效的純化 方法 熱變性及鎳親和柱層析等純化方法 使重組酶 A P E 2 3 2 5 得 到純化 經(jīng) S D S P A G E電泳分析 在分子量為 1 8 0 0 0 D a左右出現(xiàn)電 泳條帶 與預(yù)期值 1 7 8 7 1 D a A P E 2 3 2 5 七個(gè)組氨酸尾巴和凝血酶 切位點(diǎn)基本相符 并只存在單一電泳條帶 表明此酶已被純化 用 P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1 一維圖像分析軟件可以得出其精確分 子量為 1 8 2 8 6 D a 與預(yù)期值相符 第四章 A P E 2 3 2 5 的酶學(xué)性質(zhì)研究 一 實(shí)驗(yàn)材料 1 A P E 2 3 2 5 來源 由本組構(gòu)建的工程菌表達(dá) 經(jīng)純化后獲得 2 實(shí)驗(yàn)儀器 U V 5 5 7紫外可見分光光度計(jì) 熒光分光光度計(jì) R F 5 3 0 1 P C 購于日本 S H I M A D Z U 島津 公司 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 購 于 1 4 4 2 M U L T I W A V E L E I V G T H F L U O R O I M A G E R 購于 W A L L A C A R T H U R P h o r e t i x 1 D A d v a n c e d 4 0 1 P h o r e t i x 2 D A d v a n c e d 5 0 1 等 軟件購于 P e r k i n E l m e r L i f e S c i e n c e s 公司 3 實(shí)驗(yàn)試劑 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 對硝基苯酚丙酸酯 p N I T R O P H E N Y L P R O P I O N A T E 對硝基苯 酚辛酸酯 p N I T R O P H E N Y L C A P R Y L A T E 對硝基苯酚月桂酸酯 p N I T R O P H E N Y L L L A U R A T E 對 硝 基 苯 酚 棕 櫚 酸 酯 p N I T R O P H E N Y L P A L M I T A T E 對硝基苯酚硬酸酯 p N I T R O P H E N Y L S T E A R A T E a c y l 2 N 4 n i t r o b e n z o 2 o x a 1 3 d i a z o l e a m i n o c a p r o y l p h o s p h a t i d y l c h o l i n e N B D P C 購于 S i g m a試劑 公司 甲醇 乙腈 氯仿購于北京化工廠 乙酸乙酯 丙酮購于天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司 二 實(shí)驗(yàn)方法 1 如不特殊說明 測酶活方法同前 2 A P E 2 3 2 5 的底物特異性 分別稱取適量的 p N I T R O P H E N Y L P R O P I O N A T E p N I T R O P H E N Y L C A P R Y L A T E p N I T R O P H E N Y L L L A U R A T E p N I T R O P H E N Y L P A L M I T A T E和 p N I T R O P H E N Y L S T E A R A T E溶于乙腈配成 1 0 m m o l L 的底物溶液 進(jìn)行酶活測定 3 A P E 2 3 2 5 最適溫度的測定 以 N B D P C 作為反應(yīng)底物 5 0 m M T r i s H C l 緩沖液 p H 8 0 作為溶劑 然后在 5 0 1 0 0 的溫度范圍內(nèi)測定該酶的 P L A2活力 以對硝基苯酚丙酸酯作為反應(yīng)底物 5 0 m M T r i s H C l緩沖液 p H 8 0 作為溶劑 然后在 4 0 1 0 0 的溫度范圍內(nèi)測定該酶 的酯酶活力 4 A P E 2 3 2 5 最適 p H的測定 配置 5 0 m M 的不同 p H 的緩沖液 包括 p H 5 0 7 0 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 50 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 4 A P E 2 3 2 5 的熱穩(wěn)定性 由于此酶基因來自于嗜熱古細(xì)菌 所以此酶應(yīng)具有極高的熱穩(wěn) 定性 酶的熱穩(wěn)定性是嗜熱酶最顯著的特性 體現(xiàn)了嗜熱酶對極端 環(huán)境的適應(yīng)的機(jī)制 將純酶置于不同溫度 5 0 1 0 0 下保溫一 定時(shí)間后迅速冷卻 然后測定其殘留的酶活力 結(jié)果如圖 4 7 所示 406080100 Temperature 40 60 80 100 120 Relative Activity C 0204060 Time min 40 60 80 100 120 Relative Activity F i g 4 7 T h e r m o s t a b i l i t y o f A P E 2 3 2 5 A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 8 0 A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 9 0 A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 9 5 T h e a s s a y m i x t u r e c o n t a i n e d 5 0 m M T r i s H C l p H 8 0 1 0 m M 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 p N I T R O P H E N Y L P R O P I O N A T E a n d A P E 2 3 2 5 t h e n w a s r e a c t e d a t 9 0 f o r 5 m i n A l i q u o t s w e r e r e m o v e d t o d e t e r m i n e t h e r e m a i n i n g a c t i v i t y 結(jié)果表明 A P E 2 3 2 5 在 8 0 保溫 1 h 后 酶活力還剩 7 6 6 4 在 9 0 保溫 1 h 后 酶活力還剩 6 8 2 3 在 9 5 保溫 1 h 后 酶活 力還剩 5 3 5 6 說明該酶的熱穩(wěn)定性較高 5 A P E 2 3 2 5 p H 穩(wěn)定性 由圖 4 8 可以看出 A P E 2 3 2 5 在堿性 p H 7 9 范圍內(nèi)穩(wěn)定性 較高 殘余酶活在 7 0 以上 4681012 pH 0 25 50 75 100 Relative Activity 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 Km 103 3 M Vm 249 69u mg kcat 39 04s 1 7 金屬離子對酶活的影響 測試了 5種無機(jī)離子 N a K C a 2 M g 2 Z n 2 在濃度分別 為 1 m m o l L 時(shí)對酶活力的影響 表 4 2 結(jié)果表明各種均無明顯的激 活作用 除 Z n 2 對酶有較強(qiáng)的抑制作用外 其余離子未見明顯的抑 制作用 T a b l e 4 2 E f f e c t s o f d i f f e r e n t m e t a l c a t i o n s M e t a l c a t i o n s S p e c i f i c R e l a t i v e a c t i v i t y u m g a c t i v i t y B l a n k 1 7 1 8 9 1 0 0 N a 1 0 0 5 8 5 8 5 1 K 1 3 5 5 8 7 8 8 8 C a 2 1 4 1 2 8 8 2 1 1 M g 2 1 2 3 2 3 7 1 6 0 Z n 2 0 0 8 A P E 2 3 2 5 反應(yīng)活化能 恩格斯曾明確地指出 生命的起源必然是通過化學(xué)的途徑實(shí)現(xiàn) 的 也就是通過化學(xué)的進(jìn)化來實(shí)現(xiàn)的 即從一種物質(zhì)轉(zhuǎn)化成另一 種物質(zhì) 由簡單物質(zhì)轉(zhuǎn)化為復(fù)雜物質(zhì) 由無生命的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成有生 命的物質(zhì) 由生命的物質(zhì)轉(zhuǎn)化成無生命的物質(zhì) 生命的結(jié)束 在 所有這些過程中沒有一個(gè)不通過化學(xué)反應(yīng)的過程 一涉及化學(xué)反應(yīng) 過程就存在反應(yīng)快慢的問題 而反應(yīng)的快慢又取決于這個(gè)過程的反 應(yīng)活化能 活化能高 反應(yīng)慢 活化能低 則反應(yīng)快 在圖 4 5 中的曲線上選取 4 0 8 0 的 5 個(gè)點(diǎn) 用 A r r h e n i u s 做圖 法計(jì)算出活化能約為 1 7 5 5 7 k J m o l 1 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 酶 其活化能為 5 6 9 k J m o l 1 K 1 相比 A P E 2 3 2 5 反應(yīng)活化能低得 多 6 4 0 00280 00300 0032 1 T 4 5 5 0 5 5 lnv Fig 4 10 Arrhenius plot of APE 2325 9 A P E 2 3 2 5 的光譜學(xué)性質(zhì) 溫度變化可以導(dǎo)致酶活力的變化 所以我們考察不同溫度對酶 構(gòu)象的影響 即通過熒光強(qiáng)度的變化來考察酶的構(gòu)象的變化 熒光的發(fā)生是通過一個(gè)化合物吸收光子而產(chǎn)生激發(fā)態(tài) 后又因 光子的重新發(fā)射而衰退 衰退可能通過與一個(gè)分子相碰撞 或通過 分子內(nèi)能量轉(zhuǎn)移到另一個(gè)基因上去而發(fā)生 這時(shí)熒光稱為淬滅 結(jié) 合在配基上的一個(gè)蛋白質(zhì)的色氨酸的熒光淬滅 通?？勺鳛闇y定結(jié) 合程度低的一個(gè)有用手段 在水中 色氨酸的銀光強(qiáng)度非常弱 但 在蛋白質(zhì)非極性區(qū)域內(nèi) 它的熒光則可能被增強(qiáng)了 所以熒光對于 分子的構(gòu)象是敏感的 可以用來探測蛋白質(zhì) 及其聚合物 外形的 變化 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 Fig 4 12 F l u o r e s c e n c e e m i s s i o n s p e c t r a o f A P E 2 3 2 5 a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e B l u e c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 5 0 f o r 1 0 m i n R e d c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 8 0 f o r 1 0 m i n G r e e n c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 9 0 B l a c k c u r v e A P E 2 3 2 5 w a s i n c u b a t e d a t 1 0 0 四 小結(jié) 酶的基本酶學(xué)性質(zhì)是研究酶結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ) 是開發(fā)酶應(yīng)用 于特殊領(lǐng)域的必要依據(jù) 嗜熱磷脂酶 A2的酶學(xué)性質(zhì)主要包括酶的最 適作用溫度 最適 p H 酶的熱穩(wěn)定性及底物特異性等 對嗜熱酶 而言 其熱穩(wěn)定性是標(biāo)志其功能的一個(gè)重要指標(biāo) 是研究嗜熱磷脂 酶 A2適應(yīng)機(jī)制的前提和基礎(chǔ) 本章對 A P E 2 3 2 5的基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究 觀察在高溫條件 下酶的熱穩(wěn)定性 為進(jìn)一步分析酶的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系奠定基礎(chǔ) 對 純化的重組酶 A P E 2 3 2 5進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明 該酶既具有 磷脂酶 A2活力又具有酯酶活力 發(fā)揮催化活力的最適溫度為 9 0 最適 p H為 8 0 該酶具有較強(qiáng)的耐堿性和較高的熱穩(wěn)定性 酶在 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 堿性環(huán)境中穩(wěn)定性較高 保存 2 4小時(shí)之后殘余活力為 8 0 以上 但在 p H 4 0 的酸性環(huán)境中保存 2 4 小時(shí)酶活力幾乎完全喪失 在 7 0 保溫 6 0分鐘酶活力沒有損失 在 8 0 保溫 6 0分鐘酶的殘余活 力為 7 6 6 4 在 9 0 保溫 6 0 分鐘酶的殘余活力為 6 8 2 3 在 1 0 0 保溫 6 0 分鐘酶的殘余活力為 4 6 6 9 動(dòng)力學(xué)研究表明 9 0 時(shí) 的 K m k c a t V m 分別為 1 0 3 3 M 3 9 0 4 s 1 2 4 9 6 9 u m g 隨著環(huán)境溫度的升高 A P E 2 3 2 5活力增加 該酶的熒光光譜 研究表明 酶的構(gòu)象隨溫度升高也發(fā)生了相應(yīng)的變化 推測高溫使 內(nèi)部疏水性生色氨基酸暴露于溶液中 激活了酶在低溫時(shí)原始的無 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 1 氨基酸同源性分析結(jié)果 在生物學(xué)研究中 有一個(gè)常用的方法 就是通過比較分析獲取 有用的信息和知識(shí) 達(dá)爾文正是研究比較了 G a l a p a g o s f i n c h e s同其 他一些物種的形態(tài)學(xué)特征 從而提出了自然選擇學(xué)說 今天 我們 對基因和蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較 從本質(zhì)上來講是同達(dá)爾文一樣 進(jìn) 行同樣的分析 只不過更加精細(xì) 更加詳盡 在這個(gè)意義上 我們 從核酸和氨基酸的層次去分析序列的相同點(diǎn)和不同點(diǎn) 以其能夠推 測它們的結(jié)構(gòu) 功能以及進(jìn)化上的聯(lián)系 進(jìn)行序列比較的目的就是讓人們能夠判斷序列之間是否具有 足夠的相似性 從而判定二者之間是否具有同源性 雖然相似性和 同源性在某種程度上具有一致性 但它們是完全不同的兩個(gè)概念 相似性是指一種很直接的數(shù)量關(guān)系 比如部分相同或相似的百分比 或其它一些合適的度量 而同源性是指從一些數(shù)據(jù)中推測出的兩個(gè) 基因在進(jìn)化上曾具有共同祖先的結(jié)論 它是質(zhì)的判斷 進(jìn)行相似性序列分析的蛋白質(zhì)分別為 S V I P L A 2 來源于原核菌 S t r e p t o m y c e s v i o l a c e o r u b e r 1 2 2個(gè)氨 基酸 A P E 2 3 2 5 來源于古細(xì)菌 A e r o p y r u m p e r n i x K1 1 5 7 個(gè)氨基酸 A M E P L A2 來源于蜜蜂的 A p i s m e l l i f e r a 1 3 4 個(gè)氨基酸 B C A P L A2 來源于金環(huán)蛇的 B u n g a r u s c a e r u l e u s 1 1 8 個(gè)氨基酸 B T A P L A2 來源于牛的 B o s t a u r u s 1 2 3 個(gè)氨基酸 P F L P L A2 來源于細(xì)菌 P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s b v 1 2 8 個(gè)氨基 酸 S S C P L A2 來源于豬的 S u s s c r o f a 1 2 4 個(gè)氨基酸 V A M P L A2 來源于毒蛇的 V i p e r a a m m o d y t e s 1 5 7 個(gè)氨基酸 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 F i g 5 1 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f P L A2 f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s F i g 5 2 E v o l u t i o n t r e e o f P L A2 f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s 吉林大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)論文 作者 盧冬梅 F i g 5 3 S e q u e n c e a l i g n m e n t o f A P E 2 3 2