檢定菌保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程.docx

檢定菌保存、傳代、使用、銷毀標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1目的：規(guī)范藥品微生物學(xué)檢定用菌的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保微生物學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。2依據(jù)：ChP2010版（一部）、中國(guó)藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范（2010年版）。3范圍：本規(guī)程適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的申購(gòu)、保存、傳代、使用及銷毀等。4責(zé)任：4.1.QC主管負(fù)責(zé)菌種的申購(gòu)、接受、保存、分發(fā)。4.2.微生物檢驗(yàn)員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5.相關(guān)文件及術(shù)語(yǔ)：5.1術(shù)語(yǔ)標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由中國(guó)藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種制備的采用特定保存方法長(zhǎng)期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。6.標(biāo)準(zhǔn)：6.1檢定菌的申購(gòu)QC主管每年根據(jù)檢定菌種的使用情況（包括臨時(shí)檢驗(yàn)需要），提出購(gòu)買計(jì)劃，交由質(zhì)量管理部部長(zhǎng)審批后，向中檢所菌種保藏中心或?。ㄊ校┧帣z所購(gòu)買凍干菌種（標(biāo)準(zhǔn)菌種）；也可以直接向?。ㄊ校┧帣z所購(gòu)買傳代用菌種，購(gòu)買時(shí)，需詢問(wèn)與確定菌種的代數(shù)，以便傳代時(shí)控制代數(shù)。6.2檢定菌的接收菌種到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，由QC主管接收菌種，檢查其名稱和數(shù)量，以及每一支的完整性，同時(shí)將菌種的所有信息，填寫在檢定菌接收記錄（附表1）上，內(nèi)容包括：名稱、數(shù)量、編號(hào)（無(wú)編號(hào)者按檢定菌種的編號(hào)原則編號(hào)）、代數(shù)、來(lái)源、接收日期、接收人等，并將其暫貯存于48冰箱中，在一周內(nèi)必須完成轉(zhuǎn)種。6.3檢定菌的保存6.3.1工作用菌種的保存工作用菌種采用斜面低溫保存法。將菌種接種在適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌生長(zhǎng)充分以后，轉(zhuǎn)移至48冰箱中保存。此法僅用于工作用菌種的短期保存，并應(yīng)隨時(shí)檢查其污染雜菌和變異等情況，發(fā)現(xiàn)異常情況，經(jīng)應(yīng)滅活處理后銷毀。保存時(shí)間根據(jù)菌種種類而不同，細(xì)菌：1個(gè)月；酵母菌：2個(gè)月；霉菌及芽胞：3個(gè)月。6.3.2傳代用菌種的保存采用甘油冷凍管保藏法或液體石蠟保存法。6.3.2.1甘油冷凍管保存法用無(wú)菌接種環(huán)輕輕刮取經(jīng)冷凍復(fù)溶增菌后并接種至平板或瓊脂斜面的菌苔，并通過(guò)接種環(huán)與試管壁之間的輕輕摩擦而使細(xì)菌充分?jǐn)U散到預(yù)先裝入試管中的無(wú)菌純化水中，調(diào)整菌液濃度，使其等同于10號(hào)比濁管，向已制備好的菌懸液中加入等體積的無(wú)菌甘油（濃度20%），即為10%甘油菌懸液，輕輕振搖，使內(nèi)容物充分混合，分裝于無(wú)菌小試管，在-30冷凍條件下保存。此甘油冷凍管為第2代（G2）?？梢悦扛?年轉(zhuǎn)種一代。使用時(shí)，取出一支放至室溫，轉(zhuǎn)種增菌培養(yǎng)或接種至瓊脂斜面復(fù)蘇，挑取純菌落傳代或工作用。此種方法主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。6.3.2.2液體石蠟保存法6.3.2.2.1無(wú)菌液體石蠟的制備：選用優(yōu)質(zhì)化學(xué)純液體石蠟，將液體石蠟分裝加塞，用牛皮紙包好，在121滅菌30分鐘,置40恒溫箱中蒸發(fā)水分，經(jīng)無(wú)菌檢查后備用。6.3.2.2.2液體石蠟管的制備：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺(tái)下用無(wú)菌吸管吸取上述無(wú)菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20冷凍或28冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。6.3.3各菌種的保存方法、條件及期限，見(jiàn)傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限（附件1）6.4檢定菌的傳代檢定菌菌種的傳代因凍干菌（標(biāo)準(zhǔn)菌種）與傳代用菌種而不完全相同。6.4.1標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)蘇、確認(rèn)、傳代6.4.1.1標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)蘇6.4.1.1.1把凍干菌種管、滅菌毛細(xì)滴管（1ml）、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜培養(yǎng)基）數(shù)支，移入接種室或超凈工作臺(tái)。6.4.1.1.2將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點(diǎn)燃酒精燈，將標(biāo)準(zhǔn)菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱，用滅菌毛細(xì)滴管吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基），滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂。6.4.1.1.3取滅菌鑷子，在火焰旁，將炸裂的管口打開(kāi)，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌毛細(xì)滴管，在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基）少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動(dòng)促使溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（或其它適宜的培養(yǎng)基）內(nèi)，并根據(jù)不同菌種類型而將其培養(yǎng)于相宜的溫度下2472小時(shí)（細(xì)菌需要2448的培養(yǎng)物，酵母菌需要72小時(shí)的培養(yǎng)物，形成孢子的微生物則宜保藏孢子，放線菌和絲狀真菌則應(yīng)培養(yǎng)710天）。最后將毛細(xì)滴管及菌種管經(jīng)高溫滅菌（121，45分鐘）。6.4.1.1.4取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察液體培養(yǎng)基是否渾濁，渾濁說(shuō)明菌種復(fù)活生長(zhǎng)，若不渾濁，在將其作為無(wú)活菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)物丟棄以前，細(xì)菌應(yīng)至少培養(yǎng)1周以上，真菌和酵母菌至少應(yīng)培養(yǎng)2周以上，并在丟棄之前應(yīng)高溫滅活處理（121，45分鐘）。6.4.1.2標(biāo)準(zhǔn)菌種的確認(rèn)6.4.1.2.1用無(wú)菌接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌）或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基（真菌和酵母菌）平板上，或相應(yīng)的宜于該菌生長(zhǎng)的鑒別培養(yǎng)基平板上，然后在3035下培養(yǎng)3天（細(xì)菌）；2025下培養(yǎng)5天（真菌和酵母菌）。培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取生長(zhǎng)旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養(yǎng)基，每種菌劃4個(gè)平皿，以便收集較多的生長(zhǎng)旺盛的典型單菌落，進(jìn)行保存和鑒定。鑒定時(shí)作革蘭氏染色、鏡檢，觀察其染色特性及形態(tài)特征。最后再做生化實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步鑒定該菌種。若在該平板上發(fā)現(xiàn)有其它菌落生長(zhǎng)，則說(shuō)明操作有污染或菌種不純，應(yīng)將此被污染了的培養(yǎng)物滅活處理，并尋找原因。應(yīng)根據(jù)其原因采取措施重新分離挑選純菌落。6.4.1.2.2菌種的確認(rèn)結(jié)果，記錄在檢定菌種鑒定記錄上。6.4.1.2.3各檢定菌種的復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件，見(jiàn)菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件（附件2）。6.4.1.3標(biāo)準(zhǔn)菌種的傳代6.4.1.3.1按菌種說(shuō)明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第1代（G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間，分離單個(gè)純種菌落，此為第2代（G2）。6.4.1.3.2菌種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，作為保存菌種（G2），也稱傳代用菌種，同時(shí)挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第3代（W3）。6.4.1.3.3將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用于日常檢驗(yàn)。6.4.1.3.4取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間后用作工作用菌種，此仍為第3代（W3）。6.4.1.3.5將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)種后的第2代（G2）菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。6.4.1.3.6按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開(kāi)啟冷凍干燥菌種，重復(fù)上述規(guī)程操作，保存和使用菌種。6.4.1.3.7當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，在規(guī)定保存期限內(nèi)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。6.4.2傳代用菌種的傳代當(dāng)無(wú)標(biāo)準(zhǔn)用菌種時(shí)，可從?。ㄊ校┧帣z所購(gòu)買菌種作為傳代用菌種，不需經(jīng)過(guò)復(fù)溶增菌，但應(yīng)劃線接種確認(rèn)。將購(gòu)回?zé)o異常的傳代用菌種（一般為第3代），根據(jù)日常檢驗(yàn)工作的需要量，挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種(為第4代)，同時(shí)，結(jié)合菌種的代數(shù)和最長(zhǎng)保存期限，挑取純菌落制成濃菌懸液按“6.3.2”的方法制備甘油冷凍管或液體石蠟管數(shù)支，作為傳代用菌種（仍為第3代）。6.4.3工作用菌種的傳代當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時(shí)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。取在冰箱48保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔⑿聜鞔呐囵B(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。也可取用“甘油冷凍管保藏法或液體石蠟覆蓋保藏法”保存的菌種，進(jìn)行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。細(xì)菌每1個(gè)月傳代一次；酵母菌每2個(gè)月傳代一次；霉菌及芽胞每3個(gè)月傳代一次。當(dāng)超過(guò)5代，須用傳代用菌種傳代。6.4.4傳代時(shí)注意無(wú)菌操作，使菌株不死亡，不污染、不丟失。同時(shí)實(shí)驗(yàn)人員也要采取有效的預(yù)防措施進(jìn)行自我保護(hù)，如工作時(shí)必須穿工作服，佩帶無(wú)菌手套，實(shí)驗(yàn)完成以后消毒實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的區(qū)域、實(shí)驗(yàn)儀器和器具。如發(fā)生意外，如菌種泄漏或人員受傷，微生物學(xué)檢驗(yàn)人員應(yīng)立即向QC主管報(bào)告以便及時(shí)進(jìn)行處理。6.4.5傳代后，按檢定菌種的編號(hào)原則編號(hào)，并在每一支菌種管上貼上標(biāo)簽，標(biāo)簽內(nèi)容包括：名稱、編號(hào)、代數(shù)、傳代日期、操作人、有效期。交QC主管統(tǒng)一保管。同時(shí)及時(shí)填寫菌種傳代、分離記錄（附表2）。6.5檢定菌種的編號(hào)采用字母加數(shù)字表示：英文縮寫字母代次傳代日期順序號(hào)菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢桿菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙門菌（S.p）代數(shù)用一位帶有下標(biāo)數(shù)字的字母表示：傳代用菌種用G表示；工作用菌種用W表示；如G3表示傳代用菌種第3代；W3表示工作用菌種第3代。傳代日期用6位數(shù)字表示：年份取最后兩位數(shù)，月、日分別用兩位數(shù)。如2012年1月12日傳代的第一支大腸埃希菌作為傳代用菌種的編號(hào)為：E.c-G3-120112-01。6.6檢定菌種的保管6.6.1檢定菌種設(shè)專人加雙鎖保管，并對(duì)所保存的菌種建立檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬（附表3）。6.6.2檢定菌種的定期檢查與鑒定在菌種的保存期間，應(yīng)每天檢查保存菌種冰箱的溫度、菌種管的塞子是否松動(dòng)或生霉，并及時(shí)填寫檢定菌種觀察記錄（附表4），如有異常應(yīng)及時(shí)處理。菌種在保存期內(nèi)均應(yīng)根據(jù)菌種的特性（工作用菌種每轉(zhuǎn)種兩代一次、傳代用菌種每三個(gè)月一次）檢查其菌落性狀、革蘭染色、顯微鏡下菌體形態(tài)及生化特性等項(xiàng)目，若發(fā)現(xiàn)與原菌種變異較大，應(yīng)重新分離、純化、鑒定、再加以保存，并做好檢定菌種鑒定記錄（附表5）。6.6.3所保管的菌種，不能隨意轉(zhuǎn)讓其他單位和個(gè)人，需要時(shí)應(yīng)有單位證明和批準(zhǔn)手續(xù)方可供應(yīng)。6.7檢定菌種的領(lǐng)用與使用6.7.1微生物學(xué)檢驗(yàn)人員根據(jù)檢驗(yàn)需要，需到QC主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，同時(shí)填寫檢定菌種領(lǐng)用登記臺(tái)賬相關(guān)內(nèi)容。6.7.2微生物學(xué)檢驗(yàn)人員從QC主管領(lǐng)取工作用菌種或傳代用菌種，用于日常檢驗(yàn)或驗(yàn)證試驗(yàn)，使用后及時(shí)填寫檢定菌種使用登記臺(tái)賬（附表6），以便追蹤菌種使用歷史。6.8檢定菌種（廢棄）的銷毀6.8.1下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121、45分鐘濕熱滅活處理：新一代菌種制備成功后的上一代菌種；使用完后的菌種和帶有標(biāo)準(zhǔn)菌種的器具和培養(yǎng)物；超過(guò)有效期的菌種；凡被污染、變異、可疑等異常情況菌種；其他應(yīng)廢棄的菌種。6.8.2廢棄菌種的銷毀由QC主辦提出申請(qǐng)，交QC主管批準(zhǔn)后，由微生物學(xué)檢驗(yàn)員進(jìn)行滅活處理，并有其他人在場(chǎng)監(jiān)督，并填寫廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄（附表7）。7記錄歸檔本標(biāo)準(zhǔn)涉及的記錄由質(zhì)量管理部保存，保存期5年。8附則：本標(biāo)準(zhǔn)附件二份，附表六份：附件1：傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限附件2：菌種復(fù)活、劃線用培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件附表1：檢定菌接收記錄附表2：檢定菌種傳代、分離記錄附表3：檢定菌種保存、領(lǐng)用登記臺(tái)賬附表4：檢定菌種觀察記錄附表5：檢定菌種鑒定記錄附表6：檢定菌種使用登記臺(tái)賬附表7：廢棄菌種（物品）銷毀處理記錄附件1：傳代用菌種保存方法、保存溫度、保存期限菌種名稱菌種名稱保存方法保存溫度保存期限大腸埃希菌CMCC(B)44102甘油冷凍管-302年金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003甘油冷凍管-302年枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501液體石蠟管2-81年白色念珠菌CMCC(F)98001液體石蠟管2-81年黑曲霉菌CMCC(F)98003液體石蠟管2-81年乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094甘油冷凍管-302年附