中華中醫(yī)藥學(xué)刊_寧神溫膽湯對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因Caspace-3表達(dá)的影響_謝輝.pdf

第 31 卷第 3 期 2 0 1 3 年 3 月 中華中醫(yī)藥學(xué)刊 CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE Vol 31 No 3 Mar 2 0 1 3 中 華 中 醫(yī) 藥 542 學(xué) 刊 寧神溫膽湯對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡 基因 Caspace 3 表達(dá)的影響 謝輝 孟瓊 龍志江 胡久略 張彥輝 朱久宜 賀又舜 湖南中醫(yī)藥大學(xué) 湖南 長(zhǎng)沙 410007 摘要 目的 探討寧神溫膽湯對(duì)精神分裂癥模型鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡基因 Caspace 3 的表達(dá)影響 方法 將 40 只 SD 大鼠隨機(jī)分為 4 組 正常組 模型組 氯丙嗪組 寧神溫膽湯組 寧神溫膽湯組于造模前采用連續(xù)灌胃 給藥 每次給藥20 mL kg 1 相當(dāng)于灌胃20 mg kg 1 氯丙嗪組先連續(xù)灌胃等容量生理鹽水14 d 1 次 d 最后 7 d 腹腔注射氯丙嗪 4 5 mg kg 1 按體表面積計(jì)算 相當(dāng)于正常人用量 正常組和模型組用等容量生理鹽水灌 胃 灌胃 1 次 天 共 21 d 除正常組外 其它 3 組大鼠最后一天給藥 1 h 后 于左側(cè)腹腔注射阿樸嗎啡鹽酸半水 按濃度為 2 mg kg 1體重 注射量為 0 1 mL 20 g 的標(biāo)準(zhǔn)注射 誘發(fā) SD 大鼠精神分裂癥模型 觀察 15 min 后斷 頭處死 結(jié)果 模型組大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白表達(dá)的平均光密度明顯高于正常組 平均灰度值明顯低于正 常組 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P 0 01 氯丙嗪組 寧神溫膽湯組大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白表達(dá)的平均光密度 明顯低于模型組 平均灰度值明顯高于模型組 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P 0 05 寧神溫膽湯組 氯丙嗪組兩組組 間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P 0 05 結(jié)論 模型組大鼠海馬 Caspase 3 蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增高 寧神溫膽 湯治療后大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白表達(dá)明顯降低 說(shuō)明寧神溫膽湯能調(diào)控精神分裂癥模型鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞 凋亡基因 Caspase 3 表達(dá) 即抑制 Caspase 3 表達(dá) 明顯抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡 但寧神溫膽湯的作用較氯丙嗪溫和 關(guān)鍵詞 寧神溫膽湯 精神分裂癥 大鼠 Caspase 3 中圖分類號(hào) R285 5文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1673 7717 2013 03 0542 03 收稿日期 2012 10 14 基金項(xiàng)目 湖南省教育廳科學(xué)重點(diǎn)研究項(xiàng)目 10A090 湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目 CX2010B345 作者簡(jiǎn)介 謝輝 1968 女 湖南株洲人 副教授 博士 研究方向 方劑證治 Influence of Ningshen Wendan Decoction on the Expression of Schizophrenic Rats Apoptosis related Protein of Capace 3 XIE Hui MENG Qiong LONG Zhijiang HU Jiulue ZHANG Yanhui ZHU Jiuyi HE Youshu Hunan University of Traditional Chinese Medicine Changsha 410007 Hunan China Abstract Objective To investigate the influence of Ningshen Wendan decoction on Caspace 3 expression of hipp ocampal neuronal apoptosis in schizophrenia model rats Methods 40 SD rats were randomly divided into four groups nor mal group model group Ningshen Wendan decoction Chlorpromazine group Before modeling rats in Ningshen Wendan decoction group was given the continuous intragastric administration of each dose of 20 mL kg 1 equivalent to the intra gastric administration of 20 mg kg 1 Chlorpromazine group was given first intragastric administration of normal saline for 14 days once a day in the last 7 days was given intraperitoneal injection of Chlorpromazine at a dose of 4 5 mg kg 1 according to body surface area which is equivalent to the normal dosage normal and model groups were given the ca pacity of saline intragastric administration once a day totally lasting 21 days In addition to the normal group on the last day of administration in the other three groups 1 h after administration left intraperitoneal injection with Apomorphine Hydrochloride Hemihydrate at a concentration of 2 mg kg 1 body weight injection volume for 0 1 mL 20 g to induce schizophrenia model the rats were decapitated 15 min after observation Results The mean optical density of Caspase 3 protein expression in rat hippocampus of model group was significantly higher than that of the normal group the average gray value was significantly lower than that of the normal group with a statistically significant difference P 0 01 The mean optical density of Caspase 3 protein expression in Chlorpromazine group and Ningshen Wendan decoction group was significantly lower than that of the model group the average gray value was significantly higher than that of the model group with a statistically significant difference P 0 05 the difference between the two groups of Chlorpromazine group 245 第 31 卷第 3 期 2 0 1 3 年 3 月 中華中醫(yī)藥學(xué)刊 CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE Vol 31 No 3 Mar 2 0 1 3 中 華 中 醫(yī) 藥 543 學(xué) 刊 and Ningshen Wendan decoction group was statistically significant P 0 05 Conclusion The Caspase 3 protein ex pression of model rats hippocampus was significantly higher than that of control Caspase 3 protein expression in Ningsh en Wendan decoction group was significantly reduced It indicates that Ningshen Wendan decoction can control Caspase 3 expression of hippocampal neuronal apoptosis in schizophrenia model rats which means inhibiting Caspase 3 expres sion significantly and inhibiting neuronal apoptosis but the effect of Ningshen Wendan decoction is moderate compared with Chlorpromazine Key words Ningshen Wendan decoction schizophrenia rats Caspase 3 溫膽湯具有理氣化痰 清膽和胃的功效 是一首祛痰經(jīng) 典名方 臨床治療疾病的范圍十分廣泛 其中以癲狂為著 癲狂屬現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的精神分裂癥范疇 有神經(jīng)病理學(xué)提示精 神分裂存在突觸通路的改變 顯示神經(jīng)元凋亡活動(dòng)的改變 可能在疾病過(guò)程中扮演著重要角色 1 痰 作為一種病 邪 內(nèi)可影響到臟腑 外可影響到筋骨 上逆則精神錯(cuò) 亂 2 溫膽湯臨床用治無(wú)形之痰所致的精神疾患 課題組 前期研究發(fā)現(xiàn)對(duì)多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)有效 3 寧神溫膽湯在 溫膽湯的基礎(chǔ)上增加了酸棗仁 石菖蒲 前期研究亦表明其 對(duì)中樞神經(jīng)遞質(zhì)有效 4 本實(shí)驗(yàn)主要探討寧神溫膽湯對(duì) 精神分裂癥模型鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡基 Caspase 3 的表 達(dá)的影響 以揭示該藥抗精神分裂癥的部分作用機(jī)理 為臨 床推廣應(yīng)用提供依據(jù) 1材料與方法 1 1實(shí)驗(yàn)材料 1 1 1動(dòng)物SD 大鼠 SPF 級(jí) 雌性 5 200 20 g 40 只 由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合 格證 SCXK 湘 2009 0004 飼養(yǎng)條件 每籠 5 只 室溫 25 2 相對(duì)濕度 65 5 標(biāo)準(zhǔn)飼料 全營(yíng)養(yǎng)喂養(yǎng) 自由飲水 籠具每周清洗消毒 1 次 紫燈滅菌 10 min 實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)房?jī)?nèi)觀察 5 d 無(wú)異常者用于本試驗(yàn) 湖南中醫(yī)藥大學(xué) SPF 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證 號(hào) SCXK 湘 2009 0001 鼠用全價(jià)顆粒飼料由湖南斯萊 克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物專用飼料生產(chǎn)許 可證號(hào) SCXK 湘 2009 0009 1 1 2主要藥物與試劑 R 阿樸嗎啡鹽酸半水 日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社 批號(hào) 20110408 鹽酸氯丙嗪 注射液 上海和豐制藥有限公司 批號(hào) 091201 生理鹽水 四川科倫藥業(yè)股份有限公司 批號(hào) B11050207 Caspase 3 試劑盒 武漢博士德生物工程有限公司 批號(hào) 20101107 1 1 3主要儀器德國(guó)梅特勒 托力公司 PG802 S 型 電子天平 HPIAS 2000 顯微圖像定量分析系統(tǒng) 德國(guó)萊卡 公司 CM 1800 型恒溫冰凍切片機(jī) 麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有 限公司 Mo t i c B 5 雙目生物顯微鏡 1 2實(shí)驗(yàn)方法 1 2 1中藥湯劑制備寧神溫膽湯全方液 酸棗仁 10 g 石菖蒲 10 g 半夏10 g 竹茹10 g 枳實(shí)10 g 陳皮10 g 茯苓 30 g 甘草6 g 全方各藥物先加水浸泡30 min 煎加藥材量 的 8 倍水 沸騰后煎 40 min 過(guò)濾取汁 二煎加藥材量的 6 倍水 沸騰后煎 30 min 過(guò)濾 兩煎所得濾液混合后濃縮成 藥物與水的比例為 1 1 4 冰箱保存 1 2 2動(dòng)物模型建立動(dòng)物適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境 5 d 后進(jìn)行試 驗(yàn) 隨機(jī)分為 4 組 正常組 模型組 寧神溫膽湯組 鹽酸氯 丙嗪組 每組 10 只 給藥 21 d 除正常組外 其它三組大鼠 最后一天給藥 1 h 后 于左側(cè)腹腔注射阿樸嗎啡鹽酸半水 按濃度為 2 mg kg 1體重 注射量為 0 1 mL 20 g 的標(biāo)準(zhǔn) 注射 誘發(fā) SD 大鼠精神分裂癥模型 觀察 15 min 后斷頭處 死 正常組予以等量生理鹽水腹腔注射 1 2 3給藥方法寧神溫膽湯組于造模前采用連續(xù)灌胃 給藥 每次給藥 20 mL kg 1 相當(dāng)于灌胃 20 mg kg 1 鹽酸氯丙嗪組先連續(xù)灌胃等容量生理鹽水 14 d 1 次 天 最后 7 d 腹腔注射鹽酸氯丙嗪 4 5 mg kg 1 按體表面積 計(jì)算 相當(dāng)于正常人用量 正常組和模型組用等容量生理 鹽水灌胃 灌胃 1 次 天 共 21 d 1 2 4大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞 Caspase 3 蛋白指標(biāo)測(cè)定誘 發(fā) SD 大鼠精神分裂癥模型后觀察 15 min 對(duì)大鼠麻醉下行 左心室主動(dòng)脈插管后 予 4 多聚甲醛 4 灌注固定 迅 速斷頭取腦進(jìn)行后固定 用恒冷冰凍切片機(jī)行冠狀面連續(xù) 切片 從視交叉處開(kāi)始切片 片厚 10 12 m 每個(gè)標(biāo)本切 片 10 12 張 0 3 H2O2室溫下孵育 10 min 滴加5 BSA 血清封閉液 37 20 min 滴加一抗 Rabbit an ti Caspase 3 4 過(guò)夜 加生物素化二抗 37 30 min 加 SABC37oC 20 min DAB 顯色 剃度酒精脫水 二甲苯透明 中性樹(shù)膠封 片 每組次染色切片數(shù)均衡以避免 DAB 顯色時(shí)間不等對(duì) 組間造成的影響 一抗稀釋濃度為 l 200 采用 HPIAS 2O00 顯微圖像定量分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析 每組次選取 8 個(gè)視野 采用統(tǒng)一的照相倍數(shù) 統(tǒng)一采樣 對(duì)其染色強(qiáng)度 進(jìn)行定量分析 1 2 5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)用均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 珋x s 表示 各組數(shù)據(jù)比較采用 t 檢驗(yàn) P 0 05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義 P 0 01 為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用 SPSS 19 0軟件統(tǒng)計(jì)包處理 2結(jié)果 2 1病理檢測(cè)結(jié)果 如圖所示 正常組海馬有 3 4 層錐體細(xì)胞 排列整齊 緊密 神經(jīng)細(xì)胞核大而圓 透明 胞質(zhì)豐富 核仁清楚 胞漿 無(wú)棕色顆粒表達(dá) 插頁(yè) 圖 1 模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元 界限不清 包膜皺縮 細(xì)胞體積縮小 呈三角形和不規(guī)則 核 濃縮深染 核仁消失 胞漿有棕黃色顆粒表達(dá) 插頁(yè) 圖 2 寧神溫膽湯組海馬有 3 4 層錐體細(xì)胞 排列整齊緊密 神經(jīng)細(xì)胞核大而圓 透明 胞質(zhì)豐富 核仁清楚 胞漿有少量 棕色顆粒表達(dá) 插頁(yè) 圖 3 氯丙嗪組海馬的錐體細(xì)胞 排列整齊緊密 神經(jīng)細(xì)胞核大而圓 透明 胞質(zhì)豐富 核仁清 楚 插頁(yè) 圖 4 2 2寧神溫膽湯對(duì)大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白的影響 采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) Caspase 3 在 400 倍光 345 第 31 卷第 3 期 2 0 1 3 年 3 月 中華中醫(yī)藥學(xué)刊 CHINESEARCHIVESOFTRADITIONALCHINESEMEDICINE Vol 31 No 3 Mar 2 0 1 3 中 華 中 醫(yī) 藥 544 學(xué) 刊 鏡下 隨機(jī)選取 8 10 個(gè)視域進(jìn)行定量分析 測(cè)量黃褐色反 應(yīng)物的積分光度和平均面積 分析蛋白的表達(dá)情況 經(jīng)統(tǒng) 計(jì)學(xué)處理 結(jié)果表明 模型組大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白 表達(dá)的平均光密度明顯高于正常組 平均灰度值明顯低于 正常組 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P 0 01 說(shuō)明模型組大鼠 海馬區(qū) Caspase 3 蛋白表達(dá)較空白對(duì)照組明顯增高 寧 神溫膽湯組 鹽酸氯丙嗪組與模型組比較 大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白表達(dá)的平均灰度值明顯高于模型組 平均 光密度明顯低于模型組 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P 0 05 說(shuō)明寧神溫膽湯和氯丙嗪治療后大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白表達(dá)均明顯降低 寧神溫膽湯組與鹽酸氯丙嗪組比較 二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 P 0 05 說(shuō)明寧神溫膽湯組作 用較溫和 不及西藥氯丙嗪 寧神溫膽湯對(duì)大鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白 表達(dá)的影響 n 10 珋x s 組別平均光密度平均灰度 正常組0 23 0 84 138 03 15 80 模型組0 71 0 1264 41 10 46 寧神溫膽湯組0 58 0 08 81 62 6 03 鹽酸氯丙嗪組0 45 0 05 115 32 15 32 注 與模型組相比 P 0 05 與模型相比 P 0 01 與鹽 酸氯丙嗪組相比 P 0 05 3討論 哺乳動(dòng)物存在兩種不同的細(xì)胞凋亡途徑 一種是 凋 亡受體途徑 一種是 Bcl 2 家族調(diào)控的凋亡途徑 兩種凋 亡途 徑 最 終 都 會(huì) 激 活 細(xì) 胞 的 半 胱 天 冬 氨 酸 蛋 白 酶 Caspase 6 半胱天冬氨酸蛋白酶也稱 ICE 樣蛋白酶 是 細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶 促凋亡因子 Caspase 3 是半胱氨酸蛋白酶家族中最重要的成員之一 以無(wú)活性的 酶原形式存在于細(xì)胞漿中 在凋亡信號(hào)的刺激下經(jīng)蛋白酶 水解作用切去原結(jié)構(gòu)域 形成四聚體而活化 活化的 Caspase 3 參與了一系列與凋亡有關(guān)的細(xì)胞變化過(guò)程 包括 細(xì)胞內(nèi)蛋白底物的降解 凋亡抑制劑的失活 染色質(zhì)的聚 集 促使凋亡小體形成等 7 9 Caspase 3 可直接導(dǎo)致細(xì) 胞凋亡 它的活化是細(xì)胞凋亡通路的中心環(huán)節(jié) 10 其中 Caspase 3 是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最重要的蛋白酶 在各種因 素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后的樞紐作用 11 Caspase 3 與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切 精神分裂癥屬中醫(yī)癲狂范疇 癲狂早在 內(nèi)經(jīng) 中有類 似記載 其病因病機(jī)以陰陽(yáng)失調(diào) 七情內(nèi)傷 痰氣上擾 氣血 凝滯為主要因素 景岳全書(shū) 指出 癡呆癥 凡平素?zé)o痰 而或以郁結(jié) 或以不遂 或以思慮 或以疑惑 或以驚恐 而漸 致癡呆 言辭顛倒 舉動(dòng)不經(jīng) 其癥則千奇萬(wàn)怪 無(wú)所不至 溫膽湯源于南北朝名醫(yī)姚僧垣所撰 集驗(yàn)方 始見(jiàn)于唐代 王燾 外臺(tái)秘要 卷17 由半夏 橘皮 竹茹 枳實(shí) 生姜 甘草 組成 治 大病后 虛煩不得眠 此膽寒故也 溫膽湯功可 理氣化痰 清膽和胃 主治膽胃不和 痰熱內(nèi)擾引起虛煩不 眠 驚悸不寧 嘔吐呃逆 癲癇等證 經(jīng)過(guò)歷代醫(yī)家對(duì)溫膽湯 的認(rèn)識(shí)與應(yīng)用 在臨床上不拘泥于古方 依證加減 治療的疾 病范圍已經(jīng)十分廣泛 從組方可以看出溫膽湯具有鮮明的 兩大特色 一是理氣 陳皮 枳實(shí) 以祛痰 一是健脾祛濕 茯 苓 甘草 以化痰 其遣方的根本點(diǎn)均在于祛痰 加味酸棗仁 和石菖蒲可進(jìn)一步增強(qiáng)溫膽湯寧神益志的功效 通過(guò)本實(shí)驗(yàn)初步推斷 寧神溫膽湯可以有效地降低大 鼠海馬區(qū) Caspase 3 蛋白的表達(dá) 從而抑制腦細(xì)胞凋亡 這說(shuō)明寧神溫膽湯理氣化痰 清膽和胃功效可能與抑制腦 細(xì)胞凋亡有密不可分的聯(lián)系 進(jìn)一步闡明了該方治療因痰 濕內(nèi)阻而致的癲狂的部分機(jī)理 參考文獻(xiàn) 1 李國(guó)榮 朱娩兒 精神分裂癥和神經(jīng)元凋亡 J 中國(guó)神經(jīng)疾 病雜志 2007 33 10 634 637 2 邵建軍 溫膽湯加減在精神心理科應(yīng)用 132 例 J 光明中 醫(yī) 2011 26 5 964 965 3 謝輝 賀又舜 溫膽湯及其化學(xué)組份對(duì)大鼠紋狀體 DA 合成 作用影響的研究 J 中醫(yī)雜志 2004 20 3 66 67 4 賀又舜 傅俊英 袁振儀 等 寧神溫膽湯對(duì)小鼠中樞神經(jīng)遞質(zhì)影 響的實(shí)驗(yàn)研究 J 中國(guó)中醫(yī)藥雜志 1999 6 4 25 26 5 徐淑云 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué) M 北京 人民衛(wèi)生出版社 2001 856 6 AnS HishikawaY KojiT Induction of cell death in rat small in testine by ischemia reperfusion Differential roles of Fas Fasl igand and Bcl 2 Bax systems depending upon celltypes J Histochem CellBiol 2005 123 3 249 261 7 Mignotte B Vayssiere JL Mitochondria and apoptosis J Ear Biochem 1998 252 1 1 8 Bratton SB Nlacfarlane M Cain K et al Protein complexes acti vate distinct Caspase cascades in death receptor and stress in duced apoptosis J Exp Cell Res 2000 256 1 27 9 沈宏偉 易路 汪小明 等 Caspase 3 與 Bcl 2 蛋白在