基因工程的操作程序培訓課件.ppt

復習回顧,1、基因工程又稱為？基因工程的原理是? 2、基因工程中用到的工具中，“分子手術刀”是？來源是？其作用是？體現了酶的什么特性？作用部位是什么鍵？ 3、限制酶切割之后的結果是產生？從中軸線兩側切割得到的是什么末端？從中軸線處切開呢？ 4、獲得目的基因需要切幾個切口？產生幾個黏性末端？切割質粒呢？ 5、“分子縫合針”是？根據什么分為兩大類？哪兩大類？這兩類酶的區(qū)別是？ 6、DNA連接酶連接的是？DNA聚合酶連接的是？ 7、DNA連接酶作用于什么鍵？,8、載體主要有哪幾類？其中，最常用的是？它的本質是？ 9、載體必須具備的四個條件是？ 10、寫出限制酶切割后的黏性末端。,基因工程的基本操作程序,原核細胞的基因結構(補充內容）,非編碼區(qū),非編碼區(qū),編碼區(qū),編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,與RNA聚合酶結合位點,啟動子,終止子,不編碼蛋白質。,：編碼蛋白質 ,連續(xù)不間斷,編碼區(qū),非編碼區(qū),原核細胞的 基因結構,調控遺傳信息表達,上 游有啟動子，下游有終止子,真核細胞的基因結構（補充內容）,編碼區(qū),與RNA聚合酶 結合位點,內含子,外顯子,啟動子,終止子,編碼區(qū)上游,編碼區(qū)下游,真核細胞的 基因結構,編碼區(qū),非編碼區(qū),外顯子：能編碼蛋白質的序列 內含子：不能編碼蛋白質的序列,：有調控作用,上游有啟動子，下游有終止子,非編碼序列：,包括非編碼區(qū)和內含子,基因工程的基本操作程序主要包括哪幾個步驟？,1、目的基因的獲取,2、基因表達載體的構建,3、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因的檢測與鑒定,問題1,一：目的基因的獲取,如蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因，還有植物的抗?。共《?、抗細菌）基因、種子貯藏蛋白的基因，以及人的胰島素基因、干擾素基因等。,1.目的基因主要是指_,編碼蛋白質的基因,目的基因指的是：,？,也可以是具有調控作用的因子,獲取目的基因的常用方法有哪些?,1、從基因文庫中獲取目的基因 2、利用PCR技術擴增目的基因 3、人工合成目的基因,反轉錄法,化學合成法,(一)從基因文庫中獲取目的基因,將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫,1.基因文庫概念,2.基因文庫類型,（包含一種生物的所有基因）,（包含一種生物的一部分基因）,(一)從基因文庫中獲取目的基因,3.基因組文庫的構建,提取某種生物的全部DNA,用適當的 限制酶,一定大小的DNA片段,將DNA片段 與載體連接,導入受體菌中儲存,基因組文庫,4.cDNA文庫的構建,提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA,單鏈DNA,雙鏈cDNA片段,重組載體,與載體 連接,cDNA文庫,反（逆）轉錄酶,DNA 聚合酶,導入受體菌 中儲存,兩種基因文庫的主要區(qū)別如下表（課本P10）,總結,1、概念：PCR全稱為_，是一項在生 物_復制_的核酸合成技術,3、條件：,2、原理：_,多聚酶鏈式反應,體外,特定DNA片段,DNA雙鏈復制,(二)利用PCR技術擴增目的基因,模板,（目的基因）,原料(脫氧核苷酸),引物（一小段單鏈DNA）,耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）,溫度控制,4、操作前提：,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。,6、結果 ：,5、擴增形式：,指數形式（2n）,在短時間內大量擴增目的基因,7、過程：,a、變性（90-95）：雙鏈DNA模板在熱作 用下，_斷裂，形成_,b、復性（55-60）：系統(tǒng)溫度降低，引物與 DNA模板結合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，從 引物開始進行堿基互補配對，合成與 模板互補的_。,氫鍵,單鏈DNA,雙鏈,DNA鏈,(二)利用PCR技術擴增目的基因動畫演示,（三）人工合成目的基因,反轉錄法： 以目的基因轉錄成的信使RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。,化學合成法,DNA合成儀,推測,推測,合成,前提：基因比較小、核苷酸序列已知,蛋白質的氨基酸順序,mRNA核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,問題4,3、如果不知道目的基因的核苷酸序列，可采用_,獲取目的基因的三種方法應用,1、如果有目的基因的核苷酸序列，而且基因比較大，可采用_,2、如果知道目的基因的序列，而且基因比較小，可采用_,PCR技術擴增,化學合成法,從基因文庫獲取的方法,復習回顧,1、基因工程的基本操作程序的四個步驟是？核心是？ 2、目的基因指的是什么基因？ 3、獲取目的基因常用的三種方法是？其中人工合成法又包括哪兩種? 4、基因文庫包括哪兩類？ 5、PCR的原理是？PCR全稱是？PCR擴增過程中的解旋方式是？PCR需要的條件有？ 6、基因表達載體的構建的目的是？ 7、一個基因表達載體的組成包括哪幾部分？ 8、標記基因的作用是？ 9、啟動子，終止子的位置，作用？起始密碼子，終止密碼子呢？,二：基因表達載體的構建基因工程的核心,1,目的： 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。,啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，RNA聚合酶識別和結合的部位，啟動轉錄 終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉錄（與終止密碼子區(qū)別） 標記基因：鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來,3.基因表達載體的構建過程,質粒,DNA分子,限制酶處理,兩個切口 四個黏性末端,DNA連接酶,重組DNA分子（重組質粒）,同一種,一個切口 兩個黏性末端,三、將目的基因導入受體細胞,4、目的基因導入受體細胞的方法,1、將目的基因導入植物細胞的方法： （1）農桿菌轉化法 農桿菌特點：,易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數單子葉植物沒有感染能力,原理：Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。,三、目的基因導入受體細胞,構建基因表達載體,轉入,農桿菌,植物細胞,導入,穩(wěn)定維持和表達,過程：,（2）基因槍法：目的基因導入單子葉植物細胞,基因槍法,（3）花粉管通道法：將目的基因導入植物細胞,操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管還末愈合前期，剪去柱頭，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞, 特點:十分簡便經濟。,例：轉基因抗蟲棉（我國）,（4）、將目的基因導入動物細胞,方法：顯微注射法,目的基因表達載體提純 取卵（受精卵） 顯微注射 受精卵 新性狀動物,為什么動物細胞要用受精卵做受體細胞？,全能性受限制,（5）、將目的基因導入微生物細胞,微生物作受體細胞優(yōu)點： 繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少 常用菌：大腸桿菌 常用法：Ca2+處理獲得感受態(tài)細胞 （改變細胞壁的通透性） 過程：,Ca2+處理 大腸桿菌,感受態(tài) 細胞,感受態(tài)細胞 吸收DNA,表達載體 與感受態(tài) 細胞混合,導入過程完成后，全部受體細胞都能攝 入重組DNA分子嗎？,真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少，且有的會攝入載體-載體，目的基因-目的基因類型,目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？,不一定，需要檢測,問題4,問題5,檢查是否成功,分子 水平,個體水平：,檢測轉基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子雜交、DNA探針,分子雜交、DNA探針,抗原-抗體雜交、抗體,四、目的基因的檢測與鑒定,方法：,接種實驗,轉基因生 物的DNA,探針,15N,15N,14N,14N,（1）檢測轉基因生物染色體的DNA上是否插入了 目的基因,基因探針：,放射性同位素等標記的含有目的基因DNA片段,方法,DNA分子雜交技術,變性,變性,知識延伸DNA分子雜交技術,該方法是根據堿基互補配對原則，把互補的雙鏈DNA解開，把單股的DNA小片段用同位素、熒光分子或化學發(fā)光催化劑等進行標記，之后同被檢測的DNA中的同源互補序列雜交，從而檢出所要查明的DNA或基因。,變性,方法,分子雜交技術,（2）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,探針,15N,15N,轉基因生物 的mRNA,14N,14N,提取,（3）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,方法抗原-抗體雜交,Bt毒素蛋白,將Bt毒蛋白注射小鼠體內,從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體,抗體,蛋白質,出現雜交帶,脫分化,組織培養(yǎng),（4）除上述分子檢測外，有時還需進行 個體生物學水平的鑒定：如抗性特性,檢查是否成功,分子 水平,個體水平：,檢測轉基因生物染色體的DNA 上是否插入了目的基因,檢測目的基因是否轉錄出了mRNA,檢測目的基因是否翻譯成蛋白質,抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等,方法、工具：,方法、工具：,方法、工具：,DNA分子雜交、DNA探針,分子雜交、DNA探針,抗原-抗體雜交、抗體,四、目的基因的檢測與鑒定,方法：,接種實驗,歸納: 基因工程的基本操作程序,獲取目的基因 從基因文庫 利用PCR 化學方法人工合成 構建基因表達載體 目的基因、啟動子、終止子、標記基因 將目的基因導入受體