引物設(shè)計的一般原則.ppt

引物設(shè)計的一般原則 郭大偉,引物設(shè)計的一般原則,1.引物長度 7.發(fā)卡結(jié)構(gòu) 2.GC% 8.二聚體 3.Tm值 9.錯配 4.3端堿基要求 10.交叉二聚體 5.5端堿基要求 11.產(chǎn)物長度 6.G 值 12.評分,引物長度,引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不應(yīng)大于38。 引物過短又同時會引起錯配現(xiàn)象，一般來說引物長度大于16bp是必要的（不容易引起錯配）。 例如：一個長度為12bp的引物在人類基因組上存在200個潛在的退火位點(3 x 109/412=200 ).而一個長度為20bp的引物在人基因組上存在的退火位點只有1/400個. 較長的引物（28-35bp) 一般是用來區(qū)分同源性較高的模板序列或者使用于產(chǎn)生一些突變位點,GC%,引物序列的GC 含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。,Tm值,Tm DNA溶解溫度，即DNA的雙鏈?zhǔn)ヒ话霑r的溫度。 Tm 值計算的經(jīng)驗公式 Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) 退火溫度一般低于Tm，退火溫度越高，特異性越高，但雜交率越低。PCR退火溫度一般是55，變性溫度94， Tm一般在58-70 之間比較合適。 兩個引物之間的Tm值應(yīng)盡可能接近，不應(yīng)超過4,3端堿基要求,引物3端的末位堿基對Taq 酶的DNA 合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A 的錯配效率明顯高于其他3 個堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3端使用堿基A。 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有相似性較高，尤其是3端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加,3端堿基要求,5端堿基要求,5端序列對PCR 影響不太大，因此常用來引進(jìn)修飾位點或標(biāo)記物。,G 值,G 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當(dāng)選用3端G 值較低（絕對值不超過9），而5端和中間G 值相對較高的引物。引物的3端的G 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)。（能值越高越容易結(jié)合） G高于4.5時易引發(fā)產(chǎn)生引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu),發(fā)卡結(jié)構(gòu),Hairpin 一條引物自身堿基之間發(fā)生配對,二聚體,Dimer 同一條引物的兩條連之間發(fā)生堿基互補配對,錯配,Fals priming 引物與模板的發(fā)生配對的位置不止一個。盡管只有某一處可以與引物完全配對吻合，但是其它位置也可與引物之間發(fā)生不完全配對，影響延伸。,交叉二聚體,Cross dimer 兩條引物之間發(fā)生堿基配對,產(chǎn)物長度,Product