細胞工程的理論基礎.pptVIP

第二章 細胞工程的理論基礎,山東師范大學生命科學學院,動物細胞與組織培養(yǎng)（cell and tissue culture）是動物細胞工程的重要技術基礎。 動物的細胞與組織培養(yǎng)是指從活的機體中取出組織或細胞，模擬機體內生理條件，在體外建立無菌、適溫和一定營養(yǎng)條件等，使之生長和生存，并維持其結構和功能的技術。,組織培養(yǎng)的概念 組織培養(yǎng)這一名詞實際上是一個通用名詞，習慣上泛指所有的體外培養(yǎng)。根據培養(yǎng)物的不同可概括為三個不同概念：細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。,A：細胞培養(yǎng)：將組織塊用機械方法或酶解法分離成單個細胞，做成細胞懸液，再培養(yǎng)于固體基質上，成單層細胞生長，或在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)培養(yǎng)的技術稱為細胞培養(yǎng)。,B：組織培養(yǎng)：將活體的一小片組織放在盛有培養(yǎng)液的玻璃或塑料培養(yǎng)器皿中，待組織塊粘著后，沿底面平面移動生長的過程稱為組織培養(yǎng)。 從組織塊中生長出來的仍然是細胞，細胞在生長的同時也發(fā)生移動，至使組織培養(yǎng)難以長時間維持其原有結構，結果也就成了細胞培養(yǎng)。,C：器官培養(yǎng)：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結構和功能的培養(yǎng)技術。,體外培養(yǎng)的種類,二、 細胞培養(yǎng)的現(xiàn)實意義,生物技術上：生產各種生技術產品如：狂犬病、小兒麻痹 癥等病毒疫苗，表皮生長因子及干擾素、白 細胞介素等生長因子及單克隆抗體等。 科學研究上：在病毒學、免疫學、遺傳學、腫瘤學等方面。 臨床醫(yī)學上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾 病的治療等,三、細胞培養(yǎng)的優(yōu)點,1.研究的對象是活細胞 在實驗過程中，根據要求可始終保持細胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細胞的情況，包括活細胞的形態(tài)、結構、生命活動等。,2. 研究條件可以人為控制 可以根據需要，控制包括pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學的條件，同時，可以施加化學、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴格控制之下。,3. 研究的樣本可以達到比較均一性 通過細胞培養(yǎng)一定代數后，所得到的細胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細胞，需要時，可采用克隆化等方法使細胞達到純化。,4. 研究內容便于觀察、檢測和記錄 采用各種研究技術、記錄方法： 研究: 倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流 式細胞術、激光共焦顯微鏡、免疫組織化學、原 位雜交、同位素標記- 記錄: 攝影照片、縮時電影、電視-,5.研究的范圍比較廣泛 學科多： 細胞學、免疫學、腫瘤學、生物化學、遺傳學、分子生物學等 對象廣： 各種動物：低等動物-高等動物-人類 一種動物：不同年齡- 不同組織- 正?；虍惓＃[瘤-）,6.研究的費用相對較經濟 可提供大量、同一時期、重復性好的、生物學性狀相似的實驗對象,四、細胞培養(yǎng)的缺點,現(xiàn)人工模擬體內環(huán)境的技術已經很高, 但, 人工所模擬的條件與體內實際情況 仍不完全相同. 當細胞被置于體外培養(yǎng)后, 生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中, 久了，必然發(fā)生變化.,因此，對于體外培養(yǎng)的細胞，應該把他們視作一種既能保持動物體內原細胞一定的性狀、結構和功能又具有某些改變的特定的細胞群體，而不能將之與體內的細胞完全等同。,五、細胞培養(yǎng)的工作原則,有標準化的工作方法 培養(yǎng)用的液體極多（如培養(yǎng)液、胰蛋白酶、HANKS液及 抗菌素等），應由專人負責，并保證做到按規(guī)程行事，配制濃度準確，滅菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要標明名稱、濃度、消毒與否和制備日期等。 一切培養(yǎng)用品都要有固定的存放點，避免雜亂無章，其中尤其重要的是：培養(yǎng)用品與非培養(yǎng)用品應嚴格分開，已消毒品與未消毒品應分別存放。,第二節(jié) 組織培養(yǎng)的細胞生物學,一、體內外細胞的差異和分化,（一）體內外細胞的差異 培養(yǎng)細胞最多見的表現(xiàn)是：失去原有組織結構和細胞形態(tài)，分化減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖” 現(xiàn)象；表現(xiàn)為細胞趨單一化，或獲得不死性，或變成具有惡性性狀的細胞群。,1.與體內主要不同 相對孤立、相對單一 缺乏體內的系統(tǒng)作用、失去神經體液的調節(jié) 和細胞相互間的影響,2.主要表現(xiàn) 失去原有組織結構和細胞形態(tài) 分化減弱或不顯 細胞趨向單一化； 3.提示 要正確認識體外培養(yǎng)細胞 是一種特定條件下生長的細胞群體。,二、培養(yǎng)細胞形態(tài)分類,體外細胞培養(yǎng)物的生長類型,按生長方式:2型 粘附型細胞:附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。 懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下即可生長的細胞。 絕大多數有機體細胞屬粘附型細胞，只有少數細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞可在懸浮狀態(tài)下生長。,貼附(粘附)型細胞,粘附:是大多數有機體細胞在體內 生存和生長發(fā)育的基本存在方式 含義 兩方面 結果 基于粘附特性，使細胞與細胞之間相互結合形成組織， 有機體的絕大多數細胞必須 粘附于一固相表面 才能生存和生長。,培養(yǎng)時：這些細胞被放到體外環(huán)境中以后,同樣需要粘附于某一固相表面才能生存和生長，因而屬于粘附型細胞。 粘附(錨定或錨著)依賴型(性)細胞：唯有粘附于固相表面才能生存的細胞,類型 細胞在體內、外的粘附方式：存在差異 體內：粘附是全方位 外形具有復雜的立體特征 體外：多數情況，細胞只有一個附著平面 外形一般與體內時明顯不同 按照培養(yǎng)細胞粘附生長時的主要形態(tài)，可分為幾大類型,分類 根據形態(tài)大致的不同，主要2類： 上皮細胞型 成纖維細胞型 其它，不定型,上皮細胞型,名稱：僅形態(tài)上似體內，實際上不完全等于- 來源：來源于外胚層，內胚層細胞 如：皮膚及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性腫瘤 形態(tài)：類似體內的上皮細胞 扁平，不規(guī)則多角形，中有圓形核,生長特點 易相連成片 相靠緊密相連成薄層 鋪石狀 生長時呈膜狀移動 很少脫離細胞群而單個活動,體外培養(yǎng)細胞類型（1）上皮細胞型,成纖維細胞型,名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的 來源：由中胚層間充質組織起源的組織 如：真正的成纖維細胞 心肌，平滑肌，成骨細胞，血管內皮 形態(tài)：似體內成纖維細胞的形態(tài) 胞體梭形或不規(guī)則三角形 胞質向外伸出23個長短不等的突起 中有卵圓形核,生長特點 排列成放射狀，漩渦狀 并不緊靠連成片， 細胞細胞接觸易斷開而 單獨行動 游離的單獨的成纖維樣細胞， 常有幾個伸長的細胞突起,體外培養(yǎng)細胞類型（2）成纖維細胞型,貼附生長型-類型,1. 與體內同名的細胞不完全相同 如：形態(tài)相似的成纖維細胞，可不同來源 自同一動物不同組織的成纖維樣細胞相似但 發(fā)展趨向不同 2. 培養(yǎng)細胞的形態(tài)不穩(wěn)定 條件改變，細胞形態(tài)可有變化,培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定 血清 Hela 高血清 低血清 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 pH Hela 太酸或太堿 標準pH 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 細胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣 轉化與否 未轉化 轉化后 成纖維樣 可成上皮樣,懸浮生長型,概念 培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長 來源 自血，脾或骨髓， 尤以血中白細胞 癌腫細胞也可能 特點 在懸浮中生長良好 細胞圓形，單個或小細胞團,優(yōu)點 生存空間大，提供數量大 傳代方便(不需消化) 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài) 缺點 觀察不方便 很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞),三、培養(yǎng)細胞的生長特點,（一）貼附,（二）接觸抑制,（三）密度抑制,四、培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程,（一）組織培養(yǎng)細胞生命期(Life Span of Culture Cells),所謂培養(yǎng)細胞生命期，是指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長 的時間。包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。,正常培養(yǎng)的細胞周期,原代培養(yǎng)(Primary Culture)期,也稱初代培養(yǎng)，即從體內取出組織接種培養(yǎng)到第一 次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。,特點：細胞呈活躍移動，可見細胞分裂，但不旺盛。與 體內原組織在形態(tài)結構和功能活動上相似性大。,傳代期,特點：在全生命期中此期的持續(xù)時間最長，細胞增殖旺 盛，并能維持二倍體核型。,傳代：體內細胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當細胞增殖達到一定密度后，則需要分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。初代培養(yǎng)的細胞一經傳代后便改稱做細胞系（Cell Line）。,衰退期 特點：此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖， 最后衰退凋亡。,（二）體外培養(yǎng)細胞一代生存期,潛伏期 指數增生期 停滯期,所謂細胞的“一代”是指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。,（三）單個細胞的生長過程,五、體外培養(yǎng)細胞的遺傳學特征,（一）核型變化,（二）永生化和惡變,（三）細胞性別,六、體外培養(yǎng)細胞的生存環(huán)境,（一）無污染環(huán)境,（二）溫度,（三）氣體環(huán)境和氫離子濃度,七、體外培養(yǎng)細胞生存所需基本物質,（一）糖,（二）氨基酸,（三）維生素,（四）促生長因子,（五）其它物質,第三節(jié) 建立細胞系或細胞株,一、體外培養(yǎng)細胞的種類和命名,（一）初代培養(yǎng) 初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng)，即直接從體內取出的細胞、 組織和器官進行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進行傳代 培養(yǎng)(5ubculture)的細胞，便不再稱為初代培養(yǎng)，而改 稱為細胞系。,（二）細胞系 初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系。,有限細胞系 無限細胞系,(三)克隆細胞株 從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng) 或通過篩選購方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細 胞株。,(四)二倍體細胞 培養(yǎng)細胞染色體數目具有與原供體二倍細胞染色體數 相同或基本相同(2n細胞占75或80以上)的細胞群， 稱二倍體細胞培養(yǎng)。二倍體細胞在正常情況下具有限 生命期，故屬有限細胞系。,(五)腫瘤細胞系或株,是現(xiàn)有細胞系中最多的一類，我國已建立細胞系主要為這類細胞。腫瘤細胞系多由癌瘤建成，多呈上皮細胞型，常已傳幾十代或百代以上，并并具有不死性和異體接種致瘤性。,對已建成的各種細胞系或細胞株習慣上都給以名稱；細胞的命名無嚴格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什么形式，均不宜太長，以便記憶和了解，今列舉以下幾種代表性的細胞名稱供參考； HeLa：為供體患者的性名(來源于宮頸癌) CHO：中國地鼠卵巢細胞(Chinese Hamster Ovary) 宮743：富頸癌上皮細胞，1974年3月建立 NIH3T3；美國國立衛(wèi)生研究所(National Institute of Health)建立, 每3天傳代一次，每次接種3106細胞毫升。,（六）細胞系或細胞株的命名,二、建立細胞系（或株）的要求,（一）組織來源 （二）細胞生物學檢測 （三）培養(yǎng)條件和方法,三、已建立細胞系或株的簽定、管理和使用,培 養(yǎng) 簡 歷：組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、 供體正常或異常健康狀態(tài)、細胞已