酵母作為研究病原菌致病效應分子的工具.ppt

,酵母作為研究病原菌致病效應分子的工具,文獻閱讀：游明亮 2019/7/18,病原菌,病原菌（pathogenic bacteria）是指那些導致機體發(fā)病的細菌。是一群高度特化了的微生物，為了自身的生存，已適應而且必須在宿主生物體內持續(xù)存在或增殖，有時可造成宿主發(fā)病。,細菌致病性的確定,經典柯赫法則 第一，特殊的病原菌應在同一疾病中查見，在健康者不存在；第二，此病原菌能被分離培養(yǎng)而得到純種；第三，此純培養(yǎng)物接種易感動物，能導致同樣病癥；第四，自實驗感染的動物體內能重新獲得該病原菌的純培養(yǎng)。,柯赫法則隨在確定一種新的病原體時非常重要，但其有一定的局限性，某些情況并不符合該法則。如健康帶菌或隱性感染，有些病原菌迄今仍無法在體外人工培養(yǎng)，有的則沒有可用的易感動物。另外，該法則只強調了病原微生物一方面，忽略了它與宿主的相互作用，是不足之處。,基因水平的柯赫法則,第一，應在致病菌株中檢出某些毒力或其產物，而無毒力菌株中則無；第二，如有毒力菌株的某個基因被損壞，則菌株的毒力應減弱或消除。或者將此基因克隆到無毒菌株內，后者成為有毒力菌株；第三，將細菌接種動物時，這個基因應在感染的過程中表達；第四，在接種動物檢測到這個基因產物的抗體，或產生免疫保護。,細菌的致病性在很大程度上取決于其毒力因子，包括侵襲力與毒素，以及毒力因子的分泌系統。 細菌致病性的現代觀點是將病原菌、宿主及二者的相互的作用綜合考慮，糾正了只調節(jié)細菌本身的片面性，是認識的深化。,尋找一種模式生物來研究細菌致病性顯得尤為重要,酵母,酵母（Yeast）是人類文明史中被應用得最早的微生物。 例如：用于制作面包和饅頭等食品及釀酒。 酵母是屬于簡單的單細胞真菌，易于培養(yǎng)，且生長迅速，被廣泛用于現代生物學研究中。如釀酒酵母作為重要的真核模式生物，是遺傳學和分子生物學的重要研究材料。,酵母作為高等真核生物特別是人類基因組研究的模式生物，其最直接的作用體現在生物信息學領域。 1996年4月，公布測得釀酒酵母的完整基因組順序，稱為遺傳學上的里程碑。,Liu Qing， 2000,第一次獲得真核生物基因組的完整核苷酸序列,第一次獲得一種易于操作的實驗生物系統的完整基因組,優(yōu)勢,酵母是一種單細胞生物，能夠在基本培養(yǎng)基上生長，使得實驗者能夠通過改變物理或化學環(huán)境完全控制其生長。 酵母在單倍體和二倍體的狀態(tài)下均能生長，并能在實驗條件下較為方便地控制單倍體和二倍體之間的相互轉換，對其基因功能的研究十分有利。 酵母的生命周期很適合經典的遺傳學分析，使得在酵母16條染色體上構建精細的遺傳圖譜成為可能。,可利用異源基因與酵母基因的功能互補以確證基因的功能。 在酵母中進行功能互補實驗無疑是一種研究人類基因功能的捷徑。如果一個功能未知的人類基因可以補償酵母中某個具有已知功能的突變基因，則表明兩者具有相似的功能。而對于一些功能已知的人類基因，進行功能互補實驗也有重要意義。,相關實驗技術,多克隆抑制效應因子靶蛋白 酵母雙雜交相互作用蛋白 熒光標記技術效應因子的亞細胞定位 DNA翻譯圖譜分析宿主翻譯水平的反應 全基因組文庫基因篩選、分離 細胞信號轉導研究效應因子具體功能,酵母為模式生物研究病原菌致病效應分子,多克隆抑制-Multi-copy suppression,Helena Gaweska et al, 2004,用于篩選靶向的基因或者表達產物,酵母雙雜交,酵母雙雜交系統的最主要的應用是快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。,-摘自生物谷,基于基因芯片的翻譯圖譜分析,利用基因芯片進行高通量的基因翻譯圖譜的分析，可以快速進行宿主對于病原菌效應因子的反應表達分析。,/wiki/DNA_microarray,熒光標記的亞細胞定位,亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位。如僅在核內存在，還是胞質內存在，還是細胞膜上存在。 FM4-64等是有效的研究分泌活動的選擇性膜表面熒光標記物,它們在水相中沒有熒光, 當它們插入脂質膜后則顯示較強的熒光, 囊泡膜胞吐后會使細胞表面熒光增加 。,Xie Xiaoyan et al, 2004,Pathogenic genetic array（PGA）,系統性的構建雙突變型來分析與宿主的基因的聯系。 酵母中缺失某些基因的菌株能在有致病效應因子的培養(yǎng)基中生長，證明這些基因與效應因子發(fā)揮功能是有關系的。 但這個生長只是部分恢復，說明除了被敲除的基因外，效應因子還和其他基因有相互作用。,細胞信號轉導,許多致病菌利用分泌系統將受體蛋白傳遞到宿主細胞中，調節(jié)宿主的信號傳遞途徑，進而阻斷或調節(jié)宿主免疫相關的信號通路 ，從而達到致病效果。 有些效應因子具有類似信號通路中激酶的作用，如GTP激活因子。,傳統的藥物篩選,基于體外的實驗，通過小分子來抑制酶活性的方法來篩選靶向位點 ，沒有考慮到藥物進入細胞膜的通透性和靶向丟失效應 。 這種方法具有很強的特異性，能減少靶向缺失的問題。細菌效應因子的特異靶向還可以承受更少的選擇壓力，因為細菌的生長是不受影響的，這樣可以減少對藥物的抗性。,基于細胞的高通量的篩選方法,未來研究的方向,不是所有的效應因子都能在酵母中研究，因為他們的靶向過程在酵母中不是保守的。 單倍體缺失能同時于分析酵母中必需基因和非必需基因在效應因子作用后，其基因產物對酵母生長的影響。,文獻的閱讀