食品中有害有毒物質(zhì).ppt

第七章 食品中有害有毒物質(zhì),食品中的有毒有害物質(zhì)：,7.1 農(nóng)藥,7.1.1農(nóng)藥殘留概述 農(nóng)藥殘留物是指由于噴施農(nóng)藥后存留在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料、藥材中的農(nóng)藥及其降解代謝產(chǎn)物、雜質(zhì)，還包括環(huán)境背景中存有的污染或持久性農(nóng)藥的殘留物再次在商品中行成的殘留。 農(nóng)藥殘留物量是指農(nóng)藥本體物及其代謝物的殘留量的總和，并構(gòu)成不同程度的毒性。,農(nóng)藥的殘留毒性（殘毒）：殘留農(nóng)藥在食物上達(dá)到一定的濃度（即殘留量）后，人或其它高等動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)食這些食物，就會(huì)使農(nóng)藥在體內(nèi)積累起來(lái)，引起慢性中毒。 農(nóng)藥的殘毒的三個(gè)來(lái)源：施用農(nóng)藥后藥劑對(duì)作物的直接污染；作物對(duì)污染環(huán)境中農(nóng)藥的吸收；生物富集與食物鏈。 農(nóng)藥的殘毒所造成的污染是多方面的。 在農(nóng)藥殘留的分析過(guò)程中，分離技術(shù)往往占主導(dǎo)地位。由于各種色譜檢測(cè)器的選擇性，針對(duì)不同類型的有機(jī)化合物常需要不同的前處理技術(shù)。,7.1.2 農(nóng)藥的分類,根據(jù)防治對(duì)象的不同，常將防治害蟲的農(nóng)藥稱為殺蟲劑，防治紅蜘蛛的稱為殺螨劑，防治作物病菌的稱為殺菌劑，防治雜草的稱為除草劑，防治鼠類的稱為殺鼠劑。 根據(jù)化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)可分為無(wú)機(jī)農(nóng)藥、有機(jī)農(nóng)藥（例如有機(jī)氯、有機(jī)磷、有機(jī)砷、有機(jī)氟等）。 主要介紹有機(jī)氯殺蟲劑、有機(jī)磷殺蟲劑、擬除蟲菊酯殺蟲劑的殘留分析技術(shù)。,7.1.3 有機(jī)氯殺蟲劑的殘留分析 有機(jī)氯農(nóng)藥（Organochlorine pesticides, OCPs)是具有殺蟲活性的氯代烴的總稱。 OCPs分為三種類型：六六六； DDT及其類似物；環(huán)戊二烯衍生物。這三類不同的氯代烴均為神經(jīng)毒性物質(zhì)，正常環(huán)境下不易分解。易通過(guò)食物鏈在生物體脂肪中富集和積累。 從20世紀(jì)70年代開始，許多工業(yè)化國(guó)家相繼限用或禁用DDT、六六六及狄氏劑。,有機(jī)氯殺蟲劑的殘留分析方法在農(nóng)藥殘留中是研究最早的。 在有機(jī)氯農(nóng)藥（OCPs）分析領(lǐng)域最為廣泛使用的檢測(cè)技術(shù)是氣相色譜/電子捕獲檢測(cè)器（GC-ECD），它具有靈敏度高、分離效果好、定量準(zhǔn)確等特點(diǎn)，是一種經(jīng)典的分析方法。色譜柱通常是弱極性至中級(jí)性柱，檢測(cè)器一般用ECD。,DDT 1874年Baeyer首次合成。 Mller發(fā)現(xiàn)它的殺蟲作用，獲瑞士專利，并于1948年獲諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。 對(duì)溫血?jiǎng)游锛倍拘缘?，?duì)大白鼠的口服急性毒性LD50為250-500mg/kg，但DDT以及主要的代謝物DDE容易在動(dòng)物脂肪中積累。,六六六（BHC） 六六六的工業(yè)品是多種異構(gòu)體的混合物，其活性組分-BHC僅占15%左右，其余均為無(wú)效組分。 廣譜性殺蟲劑。 -BHC積累體內(nèi)的危險(xiǎn)性很小，對(duì)大白鼠口服急性毒性LD50為76-200mg/kg，積累在動(dòng)物脂肪、奶中的BHC能很快排出體外。但工業(yè)品中-BHC積累的可能性和慢性中毒性很大。,-BHC,艾氏劑 艾氏劑具有較高的蒸氣壓，可以以顆粒劑的形式作為土壤殺蟲劑。大鼠口服急性毒性LD50為67mg/kg，由于它在血液中有較高的溶解度，因此容易擴(kuò)散到所有的組織中，特別是脂肪組織。,有機(jī)氯殺蟲劑殘留的分析方法,有關(guān)有機(jī)氯殺蟲劑的殘留分析方法在農(nóng)藥殘留中是研究最早的，對(duì)于僅有BHC和DDT農(nóng)藥的前處理可用濃硫酸磺化法處理，對(duì)同時(shí)含有艾氏劑、狄氏劑等多種有機(jī)氯殺蟲劑時(shí)，一般采用氟羅里硅土柱凈化。選用的色譜柱通常是弱極性至中極性柱。檢測(cè)器一般用ECD和MSD。,水果、蔬菜中多種有機(jī)氯殘留農(nóng)藥的毛細(xì)管氣相色譜測(cè)定方法： 樣品的提取與凈化 水果、蔬菜類樣品置于組織搗碎機(jī)中高速搗碎，作為試驗(yàn)樣品。稱取樣品20g于250ml具塞三角燒瓶中，加入100ml石油醚丙酮（4：1），振蕩30min。用布氏漏斗抽濾，以適量石油醚洗滌殘?jiān)瑸V液合并于500ml分液漏斗中，用水洗滌除去丙酮。上層石油醚經(jīng)無(wú)水硫酸鈉脫水收集于三角瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至5ml。,在2cm（ID）25cm玻璃層析柱中，于底部加入少許玻璃棉，依次加入1cm高的無(wú)水硫酸鈉，5gFlorisil和1cm無(wú)水硫酸鈉。先以40ml無(wú)水乙醚石油醚液（15：85）預(yù)洗柱子，棄掉淋出液。把濃縮的樣液移入柱內(nèi)，以適量無(wú)水乙醚石油醚液（15：85）洗脫，收集全部洗脫液，于40水浴上減壓濃縮至40ml，以石油醚定容，供色譜分析。,2. 色譜條件 色譜柱：50m 0.25mm（內(nèi)徑）；膜厚0.20um，固定相為CP-Sil 19CB，彈性石英毛細(xì)管柱。 氮?dú)庾鳛榱鲃?dòng)相，進(jìn)樣溫度250，檢測(cè)器溫度300，采用不分流進(jìn)樣方式，進(jìn)樣量1uL，進(jìn)樣0.75min后吹掃。 柱溫程序：柱溫100，恒溫4min以后以8/min的速率程序升溫至240，繼續(xù)恒溫20min至樣品全部流出。,近幾年來(lái)有機(jī)氯農(nóng)藥殘留分析結(jié)果： 海鳥蛋，海豹，魚粉，魚油：毒殺芬 地表水，橄欖油：硫丹 淡水魚：DDE 飲用水：16種OCPs 水果蔬菜：924種OCPs 藥材：718種OCPs,7.1.4 有機(jī)磷殺蟲劑殘留的分析 有機(jī)磷農(nóng)藥（OPPs)是含有C-P鍵或C-O-P、C-S-P、C-N-P鍵的有機(jī)化合物。 大部分不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑。在中性和酸性條件下穩(wěn)定，不易水解，在堿性條件下易水解失效。 接觸可造成中毒，它們的毒性依賴于其結(jié)構(gòu)和功能團(tuán)。例如，含P=O鍵（如敵百蟲、對(duì)氧磷）的毒性通常比含P=S（如馬拉硫磷）大。這些化合物主要是抑制生物體內(nèi)膽堿酯酶的酶活性，導(dǎo)致乙酰膽堿這種傳導(dǎo)介質(zhì)代謝紊亂，產(chǎn)生遲發(fā)性神經(jīng)毒性，引起運(yùn)動(dòng)失調(diào)、昏迷、呼吸中樞麻痹甚至死亡。 有機(jī)磷殺蟲劑由于藥效高，易被水、酶及微生物所降解，很少殘留毒性等，因此目前在殺蟲劑的使用方面，它仍然起主要作用。,目前正式商品化的有機(jī)磷農(nóng)藥有上百種，如敵敵畏、敵百蟲、馬拉硫磷等。 敵敵畏（DDV） O，O-二甲基-O-（2，2-二氯）乙烯基磷酸酯 無(wú)色液體，有芳香味，在水中約能溶1%，能與大部分有機(jī)溶劑相溶。 DDV是一種觸殺和胃毒殺蟲劑。對(duì)蠅、蚊、飛蛾等擊倒速度很快。 對(duì)雄大鼠的口服急性毒性LD50為80mg/kg，在溫血?jiǎng)游矬w內(nèi)很快降解。,敵百蟲 O，O-二甲基-1-羥基-2，2，3-三氯乙基磷酸酯 敵百蟲是一種觸殺和胃毒殺蟲劑。對(duì)雙翅目昆蟲很有效。 敵百蟲本身對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制力很弱，但它在生理pH條件下就能轉(zhuǎn)變成強(qiáng)抑制劑DDV。,樂果 O,O-二甲基-S-（N-甲基氨基甲酰甲基）二硫代磷酸酯 第一個(gè)對(duì)哺乳動(dòng)物低毒的有機(jī)磷內(nèi)吸殺蟲劑。 樂果是一種觸殺性和內(nèi)吸性殺蟲殺螨劑。 樂果在貯存中不很穩(wěn)定，特別在溫度高和存在堿及二硫代磷酸二甲酯時(shí)會(huì)分解，主要是發(fā)生烷基化反應(yīng)。鐵可加速其分解。,檢測(cè)方法,檢測(cè)有機(jī)磷的分析方法有波譜法、色譜法、酶抑制法三大類。 波譜法是跟據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥中某些官能團(tuán)或水解、還原產(chǎn)物與特殊的顯色劑在一定的條件下，發(fā)生氧化、磺酸化、酯化、配合等化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生特定波長(zhǎng)的顏色反應(yīng)來(lái)進(jìn)行定性和定量測(cè)定，檢測(cè)限在g級(jí)水平。,色譜法 (1) 薄層色譜法是一種比較成熟的、廣泛應(yīng)用的微量快速檢測(cè)方法，檢出限達(dá)0.10.01g。 GC AOAC在20世紀(jì)80年代就對(duì)大部分有機(jī)磷農(nóng)藥建立了氣相色譜分析方法，我國(guó)食品理化檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法也采用了氣相色譜檢測(cè)有機(jī)磷殺蟲劑。隨著氣相色譜儀的普及，對(duì)可能存在有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的樣品，如食品、果蔬、飼料、水產(chǎn)品、土壤、水體及血液、化妝品等都建立了氣相色譜分析方法。,(3) HPLC 對(duì)氣相色譜不能檢測(cè)的高沸點(diǎn)或熱不穩(wěn)定、易裂解變質(zhì)的有機(jī)磷農(nóng)藥可以采用HPLC法檢測(cè)。AOAC中有近半數(shù)的有機(jī)磷農(nóng)藥都建立了HPLC法，研究報(bào)道也較多。 當(dāng)使用GC或HPLC發(fā)現(xiàn)違規(guī)的農(nóng)藥殘留時(shí)，必須使用其它方法來(lái)確認(rèn)。 可以利用GC借助其在兩根或多根極性不同的柱子上的保留時(shí)間來(lái)確認(rèn)，也可以用GC/MS。,酶抑制法是利用有機(jī)磷殺蟲劑的毒理性質(zhì)建立的一種快速檢測(cè)方法。 由于有機(jī)磷能抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使該酶分解乙酰膽堿的速度減慢或停止，再利用一些特定的顏色反應(yīng)來(lái)反映被抑制程度，從而達(dá)到檢測(cè)目的。 操作簡(jiǎn)單、速度快，不需昂貴儀器，特別適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)以及大批量樣品的篩選。 靈敏度、重復(fù)性和回收率相對(duì)較差。 新方法：酶抑制-生物芯片分析法。,茶葉中多種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量測(cè)定方法： 提取 稱取0.5g粉碎茶葉于試管中，加入2ml蒸餾水和無(wú)水硫酸鈉，在混勻器上混勻，加入2ml乙酸乙酯，混勻，離心，取上清液。殘?jiān)靡宜嵋阴ズ驼和椋?：1）混合液再提取一次，合并兩次提取液，過(guò)活性炭小柱，用乙酸乙酯：正己烷（1：1）混合液洗脫，將洗脫液低溫濃縮至0.5ml，供氣相色譜分析。外標(biāo)法峰面積定量。,色譜條件 色譜柱：HP-1石英毛細(xì)管柱，氮磷檢測(cè)器，流動(dòng)相：氮?dú)?、氫氣和空氣?程序升溫：60（保持0.5min），以10/min，至250（保持3min）。 進(jìn)樣口溫度：250。 檢測(cè)器溫度：300。 不分流進(jìn)樣：進(jìn)樣量1uL。,7.1.5 擬除蟲菊酯的殘留分析,擬除蟲菊酯（pyrethroids)是一類重要的殺蟲劑，具有高效、廣譜、低毒和生物降解等特性。 擬除蟲菊酯在化學(xué)結(jié)構(gòu)上具有共同的特點(diǎn)之一是分子結(jié)構(gòu)中含有數(shù)個(gè)不對(duì)稱碳原子，因而包含多個(gè)光學(xué)和立體異構(gòu)體。它們具有不同的生物活性，即殺蟲效果也不大相同。,擬除蟲菊酯的檢測(cè) 在植物樣品中擬除蟲菊酯的測(cè)定要點(diǎn)： 提取一般采用勻漿提取法，對(duì)于色素較深的樣品，可在勻漿時(shí)加入活性炭再進(jìn)行。也有用索氏提取器用乙醚提取的報(bào)道。 提取溶劑多用丙酮。 凈化通常采取液液分配加柱層析法，層析柱填料多用氟羅里硅土和硅膠。 檢測(cè)儀器一般用氣相色譜帶電子捕獲檢測(cè)器，但也有用HPLC/UV的報(bào)道。 氣相色譜測(cè)定一般采用非極性至弱極性柱。,除蟲菊酯農(nóng)藥熱穩(wěn)定性較高，使用毛細(xì)管色譜柱在高溫區(qū)段（250-280）有利于分離，雜質(zhì)干擾較少，用ECD檢測(cè)靈敏度較高，可以滿足食品中擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留量的測(cè)定。 將有機(jī)氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥同時(shí)測(cè)定，在一般情況下，有機(jī)氯如BHC、DDT出峰在前，而擬除蟲菊酯出峰在后。,水果、蔬菜中擬除蟲菊酯殘留量測(cè)定 1.前處理 稱取約20g試樣，至于錐形瓶中，加入適量丙酮，振蕩40min，過(guò)濾。用丙酮洗滌殘?jiān)?，將濾液收集在100ml容量瓶中，并用丙酮定容。 吸取5ml提取液于具塞離心管中，加入20ml2硫酸鈉溶液，用正己烷萃取兩次。合并萃取液，并通過(guò)無(wú)水硫酸鈉柱脫水并以少量正己烷洗滌柱。流出液合并后濃縮至1ml。在微型層析柱的下端填入少量脫脂棉，依次裝入0.5cm高的無(wú)水硫酸鈉、1g硅膠和1cm高的無(wú)水硫酸鈉。用5ml正己烷預(yù)淋洗層析柱，棄去流出液。將濃縮液倒入柱內(nèi)，以二氯甲烷淋洗層析柱，收集洗脫液，濃縮至干，再以正己烷定容，供氣相色譜測(cè)定。,2. 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱 氮?dú)猓?ml/min 柱溫：60（保持0.5min），以10/min，至280（保持20min） 進(jìn)樣口溫度：260 檢測(cè)器ECD溫度：280 進(jìn)樣方式：不分流,7.1.6 多種類農(nóng)藥殘留量測(cè)定方法,目前國(guó)際上通常是使用一個(gè)前處理方法，用不同的儀器系列測(cè)定，同時(shí)測(cè)定多達(dá)上百種的農(nóng)藥，特別是GC/MS方法的使用使得在色譜上難以分離的化合物用選擇離子的方式進(jìn)行分別測(cè)定，可在一次進(jìn)樣中測(cè)定200多種農(nóng)藥。 例：茶葉中多雜環(huán)類農(nóng)藥殘留測(cè)定 用GC/ECD檢測(cè)懷疑含有的有機(jī)氯農(nóng)藥殘留，再以GC/MS-MS進(jìn)行確認(rèn)及定量分析。,水果、蔬菜和牛奶中農(nóng)藥殘留的氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析 1.提取 取50g切碎的樣品（或牛奶）于搗碎器中，加入100ml乙腈乙醇（95：5）混合液，搗碎5min。加入15g氯化鈉，繼續(xù)搗碎5min。轉(zhuǎn)移40ml上層有機(jī)相于200ml離心瓶中，加入15g無(wú)水硫酸鈉充分振蕩，高速離心5min。定量移取30m至濃縮管中，通N2在35下濃縮至5ml。在固相萃取柱中加2cm無(wú)水硫酸鈉，用5ml甲苯淋洗。將75ml淋洗液儲(chǔ)備管、Envi-Carb固相萃取柱、SAX固相萃取柱和PSA固相萃取柱從上至下，按順序相連，用乙腈-甲苯（3：1）預(yù)淋。將濃縮液轉(zhuǎn)到儲(chǔ)備管中，通氮?dú)鈱悠吠迫隕nvi-Carb柱中。每次用10ml乙腈-甲苯（3：1）淋洗，共淋洗4次，收集淋洗液于濃縮瓶中，并濃縮至1ml。加入約10ml丙酮再濃縮至2ml。,2. 儀器條件 GC/MS-MS條件 離子阱溫度200 進(jìn)樣口溫度：升溫程序?yàn)槌跏紲囟?3，初始時(shí)間0.3min，升溫速率300/min，最終溫度250。 柱壓：10psi（1psi6894.76Pa） 分流閥：初始條件，打開；0.45min，關(guān)閉；2min，打開；流比：100 進(jìn)樣量：5ul GC條件 初始溫度55，保持2min，以10/min升至230，保持10min，以20/min升至275，保持19min。,7.2 獸藥,在食用動(dòng)物飼養(yǎng)過(guò)程中廣泛使用藥物，會(huì)造成藥物殘留在可食用產(chǎn)品中。動(dòng)物性食品的藥物殘留會(huì)對(duì)人類健康產(chǎn)生影響。 獸藥的檢測(cè)方法包括：篩查，檢測(cè)和確認(rèn)。 篩查方法是就某種基質(zhì)中一定濃度的某種藥物做出陽(yáng)性或陰性反應(yīng)的試驗(yàn)方法：微生物抑制試驗(yàn)（用于對(duì)大批量樣品進(jìn)行抗生素篩查）、放射和酶免疫快速測(cè)試盒（對(duì)指定藥物的篩查）。只能分類，不能確認(rèn)是某種具體的化合物。 如果樣品中確實(shí)存在違規(guī)的藥物殘留，就需要使用其它的分析方法來(lái)確認(rèn)：薄層色譜法、GC、HPLC、GC/MS和HPLC/MS。,7.2.1 -興奮劑的殘留分析,-激動(dòng)劑，在化學(xué)上屬苯乙醇胺，為兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的化學(xué)類似物。一般可分為含取代基的苯胺型（如克倫特羅）和苯酚型（如沙丁胺醇）兩大類。 它能與肌體絕大多數(shù)組織細(xì)胞膜上-受體發(fā)生作用。 某些合成的-激動(dòng)劑，當(dāng)以高劑量飼養(yǎng)動(dòng)物時(shí)，會(huì)導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從脂肪組織向肌肉組織的轉(zhuǎn)移，使畜禽瘦肉增加。由于這種用法造成的可是用組織中的藥物殘留在毒理學(xué)等方面的種種問(wèn)題，致使許多國(guó)家禁止在使用動(dòng)物中使用該類藥物。,測(cè)定方法,檢測(cè)-興奮劑的樣品種類很多，有飼料、尿、血漿、內(nèi)臟（肝、腎）、肌肉、毛發(fā)、視網(wǎng)膜等。其中最能積累-興奮劑的是內(nèi)臟、視網(wǎng)膜。所以，在上述樣品中，檢測(cè)是否違法使用-興奮劑作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑的合適樣品是肝臟。另外，尿樣本前處理較簡(jiǎn)單，可實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。,樣品的前處理 樣品的前處理包括樣品提取、酶解（酸解）、凈化，如果采用GC檢測(cè)，還增加衍生化步驟。 -興奮劑檢測(cè)進(jìn)行酸解、酶解的必要性：因?yàn)?興奮劑在樣品中往往會(huì)與其它成分形成結(jié)合物，如在葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相結(jié)合，所以樣品在提取氏要用酸或酶水解。 酶解、酸解的條件選擇：酶的品種、酶解的酶用量、酶解時(shí)間,提取 提取的方法有液液萃取法、固相萃取法、超臨界提取法。 凈化 最常用的凈化手段是固相萃取法（SPE），也有人采用免疫親和色譜法、液液凈化法。 免疫親和色譜法：用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)出特異性抗體，抗體純化后被結(jié)合到瓊脂糖膠上制成柱，樣品上柱后， -興奮劑就與這些柱上的抗體結(jié)合在一起而保留下來(lái)，然后再用溶劑洗脫?，F(xiàn)在已有商品化的可重復(fù)使用的IAC柱。,衍生化 GC/MS、GC/FTIR確證前，采用衍生化技術(shù)以提高檢測(cè)靈敏度。最常用的衍生化試劑有：三甲基硅烷（TMS）、環(huán)狀二甲基硅烷嗎啉（DMS）。另外還有碳酰氯（COCl2）、甲基硼酸（MBA）、五氟一丙酐。,2. 檢測(cè),GC/MS 這是-興奮劑檢測(cè)非常有效、靈敏、準(zhǔn)確的手段，電離方式有電子轟擊EI、化學(xué)離子化CI兩種方式。 采用TMS作衍生化試劑、EI電離方式電離某些-興奮劑的碎片如下： 克倫特羅：86，262，243，333，277，187 沙丁胺醇：86，369，350，440，384，294 特布他林：86，356，336，426，370，280,HPLC 常用的檢測(cè)器有紫外（UV）、熒光、電化學(xué)等。 免疫分析法 放射免疫分析法、酶免疫分析法 優(yōu)點(diǎn)：一次可處理多個(gè)樣品、有商品化試劑盒供應(yīng)，檢測(cè)靈敏度高 薄層色譜法 HPLC/MS GC/FTIR,合成的-激動(dòng)劑,瘦肉精克倫特羅；鹽酸克倫特羅；鹽酸雙氯醇胺；克喘素；氨哮素；氨必妥；氨雙氯喘通；氨雙氯醇胺。,化學(xué)名為“2-（叔丁氨基）甲基4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽”，是一種從天然兒茶酚胺衍生合成的化合物；也稱羥甲叔丁腎上腺素, 是一種強(qiáng)效興奮劑。,上世紀(jì)80年代初，美國(guó)脂胺公司研究人員意外地發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅加入飼料中，能夠改變營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝途徑，促進(jìn)動(dòng)物肌肉特別是骨胳肌蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)抑制脂肪合成，從而促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，增加瘦肉率。根據(jù)試驗(yàn)得出，在飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅，可以提高飼料轉(zhuǎn)化率、生長(zhǎng)速率、瘦肉相對(duì)增加10以上，于是這項(xiàng)技術(shù)開始在養(yǎng)殖業(yè)中大行其道。,瘦肉精用于養(yǎng)殖的發(fā)現(xiàn),作用機(jī)理,它的主要作用機(jī)理是作為一種強(qiáng)效激動(dòng)劑，選擇性的作用于腎上腺素2受體上，激活腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)，使環(huán)磷腺苷增加，加強(qiáng)脂肪分解，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，實(shí)現(xiàn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)再分配，故又將瘦肉精稱作“生長(zhǎng)促進(jìn)劑(growth promoter)”和營(yíng)養(yǎng)“重分配劑(repartitioning agent)”。,為提高豬肉的瘦肉率，瘦肉精作為飼料添加劑，使用劑量是人用藥劑量的10倍以上。它用量大、使用的時(shí)間長(zhǎng)、代謝慢，所以屠宰后上市的豬肉中瘦肉精殘留量很大。同時(shí)該藥化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般加熱方法不能將其破壞。殘留藥物通過(guò)食物進(jìn)入人體，大量積蓄使人中毒。如果一次攝入量過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重中毒。,瘦肉精的危害,對(duì)人的危害的主要表現(xiàn),反復(fù)使用會(huì)產(chǎn)生耐受性，對(duì)支氣管擴(kuò)張作用減弱及持續(xù)時(shí)間縮短。,克倫特羅還可通過(guò)胎盤屏障進(jìn)入胎兒體內(nèi)產(chǎn)生蓄積，從而影響子代。,易引起急性中毒：表現(xiàn)為心悸，面頸、四肢肌肉顫抖，頭暈、乏力。心動(dòng)過(guò)速，室性早博，心電圖示S-T段壓低與T波倒置。,與糖皮質(zhì)激素合用可引起低血鉀，從而導(dǎo)致心律失常。,1998年5月，香港因內(nèi)地供港豬肉內(nèi)臟含-興奮劑而發(fā)生中毒事件，事后在寧波供港豬場(chǎng)和基地牧場(chǎng)查出-興奮劑等違禁藥品4000多公斤。,動(dòng)物性食品中毒案例一,2001年8月22日，廣東信宜市510人因食用殘留鹽酸克倫特羅的豬肉而中毒，其中51人出現(xiàn)嚴(yán)重的中毒現(xiàn)象。 11月7日廣東省河源市484人，也都因食用含有鹽酸克倫特羅的豬肉或豬肝而中毒。,動(dòng)物性食品中毒案例二,無(wú)公害豬肉理化指標(biāo),克倫特羅藥物的允許量,但當(dāng)前瘦肉精卻屢禁不止，原因之一就是國(guó)內(nèi)外檢測(cè)CLB的方法手段還不夠完善，還沒有建立宰前監(jiān)測(cè)體系和準(zhǔn)確迅速方便精確的檢測(cè)方法，從而使不法分子有機(jī)可乘。,當(dāng)前現(xiàn)狀,感官識(shí)別,色譜檢測(cè)技術(shù),免疫分析技術(shù)(IA),綜合化學(xué)法,電化學(xué)檢測(cè),瘦肉精的檢測(cè)方法,一般含鹽酸克倫特羅的豬肉色特別鮮紅，脂肪非常薄，肉皮緊貼著瘦肉，瘦肉纖維比較疏松，肉皮與瘦肉之間幾乎無(wú)肥肉( 肥膘厚度不到1.5cm) 一般健康肉淡紅色肉質(zhì)彈性好 通過(guò)這種感官識(shí)別方法就可以快速簡(jiǎn)單定性對(duì)動(dòng)物性食品中有無(wú)CLB作出初步判定。 缺點(diǎn)：只是一種經(jīng)驗(yàn)的判斷，不夠準(zhǔn)確,感官識(shí)別,無(wú)公害豬肉感官指標(biāo),色譜檢測(cè)技術(shù),毛細(xì)管區(qū)帶電泳法(CE),高效液相色譜質(zhì)-譜聯(lián)用法(HPLC-MS),氣相色譜-傅立葉紅外聯(lián)用法(GC- FTIR),薄層色譜法(TLC),色譜檢測(cè)技術(shù),克倫特羅在碳糊電極和鉑碳電極表面有不可逆氧化波產(chǎn)生，可直接采用電化學(xué)方法進(jìn)行測(cè)定。 但是，電化學(xué)系統(tǒng)儀器和毛細(xì)管電泳儀均不是一般實(shí)驗(yàn)室常備檢測(cè)儀器，不利于大量樣品中克倫特羅殘留測(cè)定。,電化學(xué)檢測(cè)技術(shù),綜合化學(xué)法,根據(jù)CLB的化學(xué)結(jié)構(gòu)，CLB可顯芳香第一胺類的鑒別反應(yīng)，也可以顯氯化物的鑒別反應(yīng)。 該法儀器與試劑廉價(jià)，無(wú)復(fù)雜的樣品前處理，操作簡(jiǎn)單，適合基層防疫工作者初選CLB殘留的方法。 但最低檢測(cè)限較高，靈敏度低。,免疫分析技術(shù)(IA),免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)的新型分析技術(shù)。 免疫反應(yīng)具有很高的選擇性和靈敏性，因此，免疫分析技術(shù)無(wú)論作為獸藥殘留分析的檢測(cè)手段還是樣本凈化方法都能使分析過(guò)程特別是前處理步驟大大簡(jiǎn)化。,免疫分析技術(shù)(IA),酶免疫分析技術(shù)(EIA),放射免疫分析技術(shù)(RIA),熒光免疫分析法(簡(jiǎn)稱熒免法，F(xiàn)IA),膠體金免疫技術(shù)(DIGFA),根據(jù)檢測(cè)CLB標(biāo)記物的不同主要有：,放射免疫分析法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便，易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)；目前國(guó)外已有很多RIA試劑盒投放市場(chǎng)，這些試劑盒可檢測(cè)一種或多種-興奮劑。 但是由于放射免疫分析法需要較昂貴的液體閃爍儀或放射儀，且放射性同位素對(duì)工作人員有一定的傷害，廢棄物又不易處理，這些不利因素限制了該法的廣泛應(yīng)用。,放射免疫,熒光免疫分析法(FIA) 克服了放射免疫法中的核輻射缺點(diǎn)。其檢測(cè)限10ng/ml。 熒免法檢測(cè)藥物殘留具有特異性高，穩(wěn)定性好，對(duì)樣品處理要求簡(jiǎn)單，一次可檢測(cè)多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)。 缺點(diǎn)是對(duì)溫度的強(qiáng)烈依賴性和熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)波長(zhǎng)，因此在藥物分析方面應(yīng)用較少。,熒光免疫,金標(biāo)免疫分析技術(shù)采用膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程。最大特點(diǎn)是單份測(cè)定、簡(jiǎn)單快速、特異敏感，10min左右就可以看到顏色鮮明的測(cè)試結(jié)果。其檢測(cè)靈敏度為510 ng/ml。 但其大批量測(cè)定時(shí)費(fèi)用高于現(xiàn)有的酶標(biāo)記法。,膠體金免疫分析技術(shù)(GICA),酶免疫分析,7.2.2 抗生素,廣義抗生素包括微生物的抗生素（抗細(xì)菌、抗真菌、抗立克次體、抗衣原體和抗病毒等）和抗腫瘤抗生素。 常用的抗生素（或臨床抗生素）主要是指抗微生物感染的抗生素。,抗生素的分類,7.2.2.1 -內(nèi)酰胺類抗生素,-內(nèi)酰胺類抗生素包括了種類繁多的天然和半合成化合物，所有這些化合物都具有-內(nèi)酰胺環(huán)的共同結(jié)構(gòu)。 第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的是青霉素G。 -內(nèi)酰胺類是破壞細(xì)菌細(xì)胞壁的繁殖期殺菌性抗生素。由于它們對(duì)細(xì)菌的選擇性作用強(qiáng)，而對(duì)人幾乎沒有毒性，所以是一類高效低毒的抗生素。但是青霉素類會(huì)使一些敏感個(gè)體產(chǎn)生十分劇烈的過(guò)敏反應(yīng)。,青霉素,青霉素G penicillin G,又名芐青霉素 benzyl penicillin 具有青霉素的基本結(jié)構(gòu),其側(cè)鏈為芐基，故稱芐青霉素。 藥動(dòng)學(xué)：青霉素G在室溫下粉劑穩(wěn)定，水溶液不穩(wěn)定。口服易被胃酸破壞，吸收極少；肌肉注射吸收快而全，分布于細(xì)胞外液，腦膜炎時(shí)可透入腦脊液；由腎小管主動(dòng)分泌而排泄，此過(guò)程受丙磺舒影響。,作用機(jī)制：青霉素類的-內(nèi)酰胺環(huán)與抗菌活性有關(guān)，而噻唑環(huán)與過(guò)敏反應(yīng)有關(guān)。青霉素與青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）結(jié)合后，青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)抑制PBPs中轉(zhuǎn)肽酶的交叉聯(lián)結(jié)反應(yīng)，阻礙細(xì)胞壁粘肽生成，使細(xì)胞壁缺損；另外青霉素還可激活細(xì)菌的自溶酶，從而使細(xì)菌體破裂死亡。 抗菌作用：青霉素G主要對(duì)G+細(xì)菌和G-球菌有效，特別是繁殖旺盛的細(xì)菌；此外，對(duì)螺旋體、防線菌也有很強(qiáng)的作用。,臨床應(yīng)用：主治G+菌感染，對(duì)G-球菌感染如淋病、流腦也有良效；對(duì)梅毒、回歸熱、鉤端螺旋體感染也有特效。 不良反應(yīng)： 1.局部刺激癥狀如注射部位疼痛、硬結(jié)較常發(fā)生； 2.過(guò)敏反應(yīng)，特別是過(guò)敏性休克。過(guò)敏反應(yīng)重在預(yù)防，過(guò)敏性休克一旦發(fā)生要積極搶救；肌肉或靜脈注射腎上腺素，同時(shí)采取其他措施，如吸氧、輸液、人工呼吸、氣管切開等。,各國(guó)對(duì)食品中，特別是在牛奶中，對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素都制定了比較嚴(yán)格的最大殘留量。 中國(guó): 牛奶中氨芐青霉素的MRL為 4ng/g。 目前對(duì)于一些常見的青霉素類抗生素殘留最常用、最便捷的檢測(cè)方法是ELISA，但化學(xué)檢測(cè)方法作為最終評(píng)判越來(lái)越受到重視，如采用大氣壓電離源(APCI、ESI等）HPLC-MS具有測(cè)定小于10-9級(jí)-內(nèi)酰胺類殘留的能力。,HPLC/MS法測(cè)定牛奶中青霉素類方法： 牛奶在3-4，13800r/min高速離心30min，去除蛋白。取上清液與等體積的0.1M磷酸緩沖溶液（pH9.2）混勻。加入正己烷混勻后離心，將水相轉(zhuǎn)移至Bakerbond C18 SPE柱，分別用2氯化鈉、水吝惜，50mM磷酸緩沖液與乙腈（1：1）混合液洗脫。洗脫液經(jīng)氮?dú)鉂饪s，用甲酸調(diào)節(jié)pH值至6-7，用水定容至1ml。 色譜條件：YMC ODS-AQ色譜柱，流動(dòng)相為水和乙腈，以不同的配比進(jìn)行梯度洗脫。 質(zhì)譜：錐體電壓為18-20V，碰撞能量10-24ev。,7.2.2.2 四環(huán)族抗生素,四環(huán)族抗生素屬快效抑菌劑。其作用機(jī)制主要是抑制細(xì)菌肽鏈的增長(zhǎng)和蛋白質(zhì)的合成，并可引起細(xì)菌細(xì)胞膜通透性改變，從而抑制DNA的復(fù)制。 四環(huán)素類有天然品四環(huán)素、土霉素及半合成品多西環(huán)素、米諾環(huán)素。其中米諾環(huán)素的抗菌作用最強(qiáng)，多西環(huán)素其次，四環(huán)素和土霉素最差。,對(duì)于四環(huán)素類化合物的檢測(cè)，主要采用液相色譜法，如EEC方法中采用金屬螯合物形式純化樣品，經(jīng)液相色譜分析的技術(shù)路線，即用0.5g/L CuSO4溶液對(duì)瓊脂糖樹脂進(jìn)行螯合反應(yīng)后，用pH4.0琥珀酸溶液沖洗制得。同時(shí)用相同琥珀酸提取組織樣品中四環(huán)素殘留物，經(jīng)螯合柱富集濃縮后，用EDTA/琥珀酸溶液洗脫，洗脫液再經(jīng)XAD-2柱進(jìn)行離子交換型吸附，用甲醇洗脫，經(jīng)蒸除溶劑，溶解殘?jiān)炔襟E制得分析樣品，用HPLC/UV檢測(cè)。,在前處理過(guò)程中，也可采用氨基鍵合的固相萃取柱方式提取、凈化樣品，用HPLC后接AlCl3溶液進(jìn)行柱后衍生化，經(jīng)熒光檢測(cè)。 值得注意的是，四環(huán)素類在高pH值條件下，極易與金屬離子結(jié)合，給色譜分析造成負(fù)面影響，因此在HPLC分析中，經(jīng)常用磷酸鹽等緩沖溶液控制酸度，但由于這類緩沖溶液具有較強(qiáng)的離子抑制作用，不適合HPLC-MS法。 在HPLC-MS分析時(shí)，常用于控制酸度的是甲酸、乙酸、草酸等具有一定揮發(fā)性的酸性物質(zhì)。,氯霉素是一種廣譜抗生素藥。它的抗菌作用是通過(guò)在生物體內(nèi)將硝基還原成亞硝基，而后亞硝基不可逆地同線粒體細(xì)胞結(jié)合，抑制了細(xì)菌細(xì)胞形成所必需的蛋白質(zhì)的合成。 由于氯霉素對(duì)造血系統(tǒng)的不良反應(yīng)，臨床上僅限用于其它抗生素?zé)o效或不適用的病例。 接觸CAP可導(dǎo)致一些個(gè)體產(chǎn)生變態(tài)過(guò)敏性反應(yīng)，產(chǎn)生皮疹、發(fā)燒，并有可能腸出血。 當(dāng)使用CAP時(shí)，易感人群可患再生障礙性貧血，這是一種潛在的致死的血液失調(diào)，并可能發(fā)展成為白血病。,7.2.2.3 氯霉素（CAP),FAO/WHO在1994年的第四十二屆食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)會(huì)議上作出：“由氯霉素引起的再生障礙性貧血與劑量無(wú)關(guān)，因此不能通過(guò)制定最高殘留量來(lái)加以限制”的結(jié)論，因此建議是“不設(shè)定”。 美國(guó)和加拿大不允許氯霉素用于最終為人類食用的動(dòng)物身上，僅批準(zhǔn)用于寵養(yǎng)動(dòng)物疾病的治療。 歐盟的96/23指令中把氯霉素列入禁用藥。 日本規(guī)定所有最終為人類所使用的動(dòng)物源性食品中氯霉素殘留量必須為零。,提?。簶悠分新让顾氐奶崛。ǔ２捎眉尤肴軇┖缶|(zhì)的方法。所用溶劑有乙酸乙酯、乙腈、10三氯乙酸溶液。也有其它方法，如加水均質(zhì)后，經(jīng)Extralut柱，用二氯甲烷洗脫提取；或在樣品中先加入葡糖苷酸酶，于37下酶解90min再用乙酸乙酯提取。 凈化：提取液經(jīng)濃縮后加入水后，用己烷洗滌除去脂肪等脂溶性雜質(zhì)。經(jīng)液液分配初步凈化的提取液往往達(dá)不到測(cè)定要求的純度，需經(jīng)柱層析凈化。較多用的是硅膠柱和C18小柱，也有用離子交換樹脂XAD-2和活性炭；硅膠柱和凝膠柱（Sephadex G-25)。洗脫液有乙腈水（80：20）、乙醚甲醇（70：30）、丙酮己烷（2：1）等。,測(cè)定：目前國(guó)內(nèi)外主要使用的方法有：HPLC-UV, HPLC/MS, GC-ECD, GC/MS, HPTLC, ELISA和放射免疫法等。 HPLC法：色譜柱常用C18和C8柱，流動(dòng)相通常用甲醇水、0.01M乙酸鈉緩沖液（pH4.3）乙腈，UV檢測(cè)器。 HPLC/MS法：HPLC條件同上 GC法：包括GC-ECD法和GC/MS法。測(cè)定之前需衍生化。用非極性或弱極性色譜柱，ECD、MS-EI、陰離子化學(xué)電離（NCI）檢測(cè)器。,HPTLC法：薄層板：Si60；流動(dòng)相：乙酸乙酯己烷（2：1），熒光衍生化；測(cè)定波長(zhǎng)366nm。 ELISA法：國(guó)外已有商品試劑盒供應(yīng)，檢測(cè)限低，特異性高。 放射免疫法：靈敏度高 蛋、奶、肉：GC-ECD 牛奶、牛組織：LC/MS 蛋：HPLC 肉：ELISA篩選，LC定量，GC/MS確認(rèn),7.3 毒素,生物毒素（Biotoxin)是一大類生物活性物質(zhì)的總稱，包括動(dòng)物毒素、植物毒素和微生物毒素。 生物毒素已經(jīng)對(duì)食品安全和人類健康構(gòu)成了威脅，因此，食品/飼料中生物毒素的研究也日益顯現(xiàn)出其必要性和迫切性。,7.3.1 真菌毒素,真菌毒素（Mycotoxins）是某些絲狀真菌產(chǎn)生的具有生物毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，這些毒性真菌包括曲霉、青霉、鐮刀霉、鏈格孢酶、棒孢酶和毛殼酶等。 最先被分離純化的真菌毒素是麥角生物堿（Ergot Alkaloid, 1875)和青霉酸（Penicillic Acid, 1913)。然而，對(duì)真菌毒素的真正研究卻是從1962年黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)開始的。,黃曲霉毒素（Aflatoxin) 黃曲霉和寄生曲酶是產(chǎn)生黃曲霉毒素的主要菌種，其他曲霉、毛霉、青霉、根霉等也可以產(chǎn)生黃曲霉毒素。 黃曲霉毒素最常見于花生及花生制品，玉米、棉子和一些堅(jiān)果類食品中，主要有黃曲霉毒素B1，B2，G1及G2等10多種。其中以黃曲霉毒素B1存在量最大且毒性最大。,黃曲霉毒素是已被證實(shí)的致癌物，其中黃曲霉毒素B1、M1是強(qiáng)致癌物。 黃曲霉毒素作用機(jī)理是影響細(xì)胞膜，抑制RNA合成并干擾某些酶的感應(yīng)方式。 中毒癥狀無(wú)特異表現(xiàn)，臨床可表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、腹瀉、肝腫大、肝出血、肝硬化、肝壞死、脂肪滲透和膽道增生等。 1993年WHO的癌癥研究機(jī)構(gòu)將其劃定為1類致癌物。它是致癌力最強(qiáng)的生物毒素，人類原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一。,黃曲霉毒素分析,食品中黃曲霉毒素的測(cè)定，主要有TLC, ELISA, HPLC等方法。 TLC法靈敏度和重現(xiàn)性較差；ELISA重現(xiàn)性差，易受樣品基質(zhì)干擾；HPLC法靈敏度和準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好，因此已成為黃曲霉毒素分析的主要手段。,HPLC法測(cè)定黃曲霉毒素，一般使用靈敏度和選擇性較好的熒光檢測(cè)器。在反相色譜中，B1和G1兩種異構(gòu)體熒光強(qiáng)度很弱，需進(jìn)行衍生化，提高其熒光強(qiáng)度，靈敏度才能滿足一般食品法規(guī)的限量。 衍生化的方法一般有柱前和柱后兩類，柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、過(guò)溴化吡啶溴以及電化學(xué)等方法。,樣品提取與凈化 樣品加入氯化鈉和甲醇水（7：3），均質(zhì)2min，過(guò)濾。取濾液加適量水，再次過(guò)濾后，上免疫親和柱，用水洗柱，最后用甲醇洗脫黃曲霉毒素，用水定容，供HPLC測(cè)定。 HPLC條件 色譜柱C18； 流動(dòng)相：甲醇乙腈水（1：1：3） 柱后衍生試劑：碘液 衍生化溫度和時(shí)間：70，55s 激發(fā)波長(zhǎng)：360nm 發(fā)射波長(zhǎng)：大于520nm,7.3.2 海洋藻類毒素,海洋藻類毒素是由海洋中的微藻或海洋細(xì)菌產(chǎn)生的一類生物活性物質(zhì)的總稱。由于這些毒素通常是通過(guò)海洋貝類或魚類等生物媒介造成人類中毒的，因此這些毒素常被稱作貝毒或魚毒。 常見的貝毒有麻痹性貝毒， 腹瀉性貝毒，記憶缺失性貝毒，神經(jīng)性貝毒等。 我國(guó)浙江、福建、廣東等地曾多次發(fā)生貝類中毒，導(dǎo)致中毒的貝類有蚶子、花蛤、香螺、織紋螺等常食用