[精品論文]Sonic Hedgehog 信號通路在脈絡膜-視網(wǎng)膜.docVIP

精品論文sonic hedgehog 信號通路在脈絡膜-視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移和血管管腔形成中 的作用5何花，李貴剛（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院眼科，武漢 430030） 摘要：【目的】目前研究表明 sonic hedgehog (shh)信號通路參與組織缺血缺氧下血管新生 的病理過程，而缺血缺氧在脈絡膜新生血管（cnv）中起著重要作用。本實驗研究旨在探 討 shh 信號通路在缺氧狀態(tài)下脈絡膜-視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及血管管腔形成中10的作用及機制?！痉椒ā坑?200 mol/l cocl2 造成體外細胞化學性缺氧，體外培養(yǎng)缺氧狀 態(tài)下的脈絡膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(rf/6a 細胞)來研究缺氧條件下 shh-ptch-gli1 信號通路及相 關(guān)信號通路中 ptch1、gli1、dll4, hes1, hif-1 等基因的時程表達規(guī)律。利用 real-time pcr 和蛋白印跡技術(shù)研究 shh 信號通路的激動劑和阻滯劑對相關(guān)調(diào)控基因（ptch1、gli1、dll4） mrna 和蛋白表達水平的影響，并進一步研究了 shh 信號通路的激動劑和阻滯劑對 rf/6a15細胞參與新生血管形成的生物學功能（包括細胞增殖，移行以及管腔形成）的影響?！窘Y(jié)果】 缺氧導致體外 rf/6a 細胞中 ptch1、gli1、dll4、hes1 和 hif-1 的表達上調(diào)。shh 信號通路激動劑 rshh 能促進相關(guān)調(diào)控基因（ptch1、gli1、dll4）mrna 和蛋白的表達，并 能促進缺氧下 rf/6a 細胞增殖、遷移和血管管腔形成。相反，shh 信號通路阻滯劑 cyclopamine 則能下調(diào)調(diào)控基因（ptch1、gli1、dll4）mrna 和蛋白的表達，并能抑制20缺氧下 rf/6a 細胞增殖、遷移和血管管腔形成。兩者作用具有顯著性差異(p0.05)?！窘Y(jié)論】 shh 信號通路可通過調(diào)節(jié)交互的 hif-1-vegf-dll4 信號通路來參與 cnv 發(fā)生發(fā)展。shh 信號通路的阻斷劑可抑制缺氧條件下脈絡膜血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及血管管腔形成。選 擇性調(diào)節(jié) shh 信號可能是 cnv 治療的新途徑。關(guān)鍵詞：sonic hedgehog；脈絡膜新生血管；血管內(nèi)皮細胞；缺氧25effect of sonic hedgehog signaling on the proliferation, migration and tube formation of hypoxic choroid-retinal endothelial cellshe hua, li guigang30(department of ophthalmololgy, tongji hospital affiliated to tongji medical college,huazhonguniversity of science and technology, wuhan 430030)abstract: 【objective】hypoxia and ischemia are thought to play an important role in theformation of choroidal neovascularization (cnv). sonic hedgehog (shh) signaling has recently been shown to be involved in the pathological angiogenesis response to tissue hypoxia and35ischemic injury. the aim of this study was to evaluate the effects of the sonic hedgehog signaling on proliferation, migration and tube formation of choroid-retinal endothelial cells under hypoxicconditions.【methods】in order to evaluate the expression and role of shh signaling during cnv,our study utilized chemical hypoxia induced by 200m cocl2 to observe the expression of shh signaling in hypoxic choroid-retinal endothelial cells (rf/6a cells), mrna and protein expression40of key genes, including ptch1, gli1 and dll4, in hypoxic rf/6a cells were investigated by real-time pcr and western blot analysis. the effects of the shh signaling on the biological function of hypoxic rf/6a cells during angiogenesis, including cell proliferation, migration and,tube formation, were investigated. 【results】the results showed that hypoxic conditions lead to upregulation of ptch1、gli1、dll4、hes and hif-1 expression in rf/6a cells in vitro. the shh基金項目：教育部新教師基金項目（基金編號 20090142120068）作者簡介：何花，女，副教授，副主任醫(yī)師，研究方向：眼脈絡膜新生血管的基礎(chǔ)研究. e-mail:- 10 -45activator (recombinant sonic hedgehog n-terminals protein, rshh) not only can promote the mrna and protein expression of ptch1, gli1, and dll4, but also induce the cell proliferation, migration and, tube formation of hypoxic rf/6a cells. on the other hand, the shh blockade (cyclopamine) can significantly down-regulate the mrna expression and protein expression of ptch1, gli1 and dll4, furthermore, reduce significantly the cell proliferation, migration and,50tube formation of hypoxic rf/6a cells【.conclusion】the sonic hedgehog signaling pathway mayact as a cross-talk signaling pathway which controls the expression of the hypoxia-regulated hif-1a-vegf-dll4 cascade in the cnv. .cyclopamine, acting as a shh blockade, may represent a novel therapeutic alternative drug by blocking the proliferation, migration and tube formation of hypoxic rf/6a cells.55keywords: sonic hedgehog; choroidal neovascularization; endothelial cells; hypoxia0引言脈絡膜新生血管（cnv，choroidal neovascularization）是來自脈絡膜的病理性新生血管， 它是年齡相關(guān)性黃斑變性等多種眼底疾病不可逆性致盲的主要原因1,2。cnv 以往研究的焦60點主要集中在血管內(nèi)皮細胞（ec）和血管內(nèi)皮生長因子（vegf）。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的 臨床治療主要傾向于玻璃體腔注射 vegf 拮抗藥物（macugen、lucentis 等）和光動力療法， 前者可抑制 ec 增殖以對抗 cnv 生長，后者則破壞 ec 導致血管栓塞，主要針對已形成的 cnv 晚期的并發(fā)病變。盡管兩者在一定程度上可改善視力，但仍未達到理想的治療效果， 患者需要長期反復多次的昂貴治療，不僅延長了病程，增加并發(fā)癥發(fā)生的風險，而且?guī)砭?5大的精神和經(jīng)濟負擔。深入研究 cnv 的發(fā)病機制和提供新的治療靶點是目前眼科的研究熱 點。cnv 本質(zhì)上是新生的病理性微血管，其發(fā)生與脈絡膜視網(wǎng)膜局部微環(huán)境的缺血和低氧 狀態(tài)息息相關(guān)3,4。sonic hedgehog（shh）信號通路是近年發(fā)現(xiàn)的血管新生的新信號通路， 研究證實 shh 信號通路是缺血或低氧損傷組織中血管新生的重要調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)5,6,7，且 shh 信號70通路（shh-ptch-gli1 通路）調(diào)控血管新生的機制與 hif-1 -vegf-dll4 信號通路有關(guān)8 。 在體外 cnv 動物模型研究中已發(fā)現(xiàn) shh 及其下游產(chǎn)物 ptch1 表達上調(diào)7 。那么 shh-ptch-gli1 信號通路如何參與了 cnv 的形成過程？目前這方面的研究報道較少。本實驗研究利用體外培養(yǎng)缺氧狀態(tài)下的脈絡膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(rf/6a 細胞)來研究缺 氧條件下 shh-ptch-gli1 信號通路的表達變化。并進一步觀察 shh 信號通路的激動劑和阻滯75劑對缺氧狀態(tài)下 rf/6a 細胞增殖、遷移以及血管管腔形成的影響，從而探討 shh 信號通路 參與 cnv 形成的作用機制。1研究方法1.1 細胞培養(yǎng)及缺氧方案從上海中科院細胞庫獲取脈絡膜-視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞系 (rf/6a 細胞),在含 10%胎牛血清80(gibco), 100 u/ml 青霉素,100 g/ml 鏈霉素的 dmem 培養(yǎng)基培養(yǎng)。血管性血友病因子(santacruz biotech., usa)免疫染色鑒定。細胞缺氧之前給予含 1%胎牛血清的 dmem 培養(yǎng)，加入 200mol/l cocl2 形成缺氧環(huán)境。 在檢測 shh 信號通路（ptch1、gli1）及相關(guān)重要調(diào)控基因（dll4、hes1、hdf-1）mrna 的時程表達規(guī)律時 rf/6a 細胞分別低氧培養(yǎng) 6h、12h、24h。在研究體外給予 shh 信85號通路的激動劑和阻斷劑對 rf/6a 細胞相關(guān)調(diào)控基因表達及細胞增殖、遷移、血管管腔形 成的影響時，rf/6a 細胞低氧培養(yǎng) 12h。1.2 實時定量 pcr由中國上海 genechem 公司對 ptch1、gli1、dll4, hes1, hif-1 和 gapdh 進行引物 設計及合成。引物序列如表 1 所示。利用 abi prism 7500 系統(tǒng) (biosystems, usa) ，用90sybr green (takara bio., japan)對 ptch1、gli1、dll4, hes1, hif-1 的 mrna 表達水平 進行實時定量 pcr 檢測。每個 cdna 樣本放入含 1 l cdna，12.5 l sybr green rt-pcr master mix (2), 以及 1 l 引物 (10 mol/l)的 25 l 容器，重復檢測三次。實時定量 pcr 檢 測步驟包括 95c 10 min 酶反應，95c15 s 變性及 60c1 min 復性共 40 周期，最后 72c20 min 延伸。利用相對 ct (ct)計算基因表達相對含量(biosystems 提供), 公式如下: 倍數(shù)改變95=2-ct, ct 表示信號達到閾值時擴增循環(huán)次數(shù)。表1 pcr引物序列tab. 1. primers used for pcr analysis100geneprimer sequenceproduct size. bp105110ptch1 forward primer: tctgctgggagtgctgatg 99reverse primer: ttgagaacgccgaggatgggli1 forward primer: ttcctaccagagtcccaagt 185reverse primer: ccctatgtgaagccctatttdll4 forward primer: aggtgcggacatccatcg 118reverse primer: ctgcccacaaagccataagghes1 forward primer: ctaccccagccagtgtcaaca 271reverse primer: aacgcagtaccggcgagtghif-1 forward primer: agaaagcagttccgcaagcc 425reverse primer: catgttccatttttcgctttctgapdh forward primer: accacagtccatgccatcac 452reverse primer: tccaccaccctgttgctgta1151201251.3 蛋白印跡技術(shù)（western blot）rf/6a 細胞放入 6 孔板，給予 12 小時的缺氧環(huán)境。pbs 沖洗 2 次后每孔給予 100 l 裂 解緩沖液，4c 冰浴 5min。依據(jù)生產(chǎn)商提供說明，用 bca protein assay kit (tianlai, china) 測量分析蛋白表達水平。每個蛋白樣本 100c 加熱 10 min 后載入 5%sds-聚丙烯酰胺凝膠， 冰轉(zhuǎn)移緩沖液(25 mmol/l tris, 192 mmol/l 糖膠, 100% 冰乙醇)中轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5% 脫脂乳封閉，一抗分別為兔抗人、鼠 patched 多克隆抗體（abcam 公司產(chǎn)品）、兔抗人、鼠 dll4 多克隆抗體（abcam 公司產(chǎn)品）、兔抗人、鼠 gli1 多克隆抗體（abcam 公司產(chǎn)品） 以及 gapdh 一抗（內(nèi)對照）檢測，結(jié)合辣根過氧化物酶的抗兔 igg 孵育。蛋白條帶以 gapdh 標準化。重復測量三次。1.4 體外給予 shh 信號通路的激動劑和阻滯劑分組干預低氧環(huán)境下（200umcocl2，培養(yǎng) 12 hour）的 rf/6a 細胞進行實驗分組，共 4 組。分別 為空白對照組、pbs 液對照組、激動劑干預組（3ug/ml rshh, rshh-重組人 shh 蛋白，r&d 公司，）、阻斷劑干預組（3ug/ml rshh+20um cyclopamine, cyclopamine ,美國 sigma 公司）。4 組低氧培養(yǎng)的 rf/6a 細胞均利用實時定量 pcr 和 western blot 技術(shù)分析 shh 信號通路相關(guān) 調(diào)控基因（ptch1、gli1、dll4）的 mrna 和蛋白表達水平。1301351401451501551.5 細胞周期的檢測利用流式細胞儀分析 4 組分組干預對低氧 rf/6a 細胞周期的影響。將 rf/6a 細胞接種在密度為每孔 1106 的 6-孔板。缺氧 12 小時后依據(jù)生產(chǎn)商提供說明 給予 bd cycletesttm plus dna reagent kit (becton dickinson, usa)。用 facs caliber cytometer (becton dickinson)對樣本進行分析。每組使用三個平行孔，實驗重復三次。1.6 細胞遷移的檢測用纖維連接蛋白包被的孔徑為 8 m 的 transwell 小室對 rf/6a 細胞遷移進行分析。將 細胞按 5104 接種至小室內(nèi)，上室用含 1% fbs 的 dmem 培養(yǎng)基孵育 1 小時后放入 24 孔板 ， 細胞會越過微孔膜向含 dmem 及 10% fbs 200 mol/l cocl2 的下室遷移。孵育 12 小時后膜 上細胞經(jīng) 4% pfa 固定 giemsa 染色 15 min。用顯微鏡計數(shù)遷移細胞數(shù)目，每個小室隨機 選擇 5 個視野。細胞分為四組: 分別為空白對照組、pbs 液對照組、激動劑干預組（3ug/ml rshh, rshh-重組人 shh 蛋白，r&d 公司，）、阻斷劑干預組（3ug/ml rshh+20um cyclopamine, cyclopamine ,美國 sigma 公司）。每組使用三個小室，實驗重復三次。1.7 血管管腔形成的檢測細胞分 4 組進行干預，分別為空白對照組、pbs 液對照組、激動劑干預組（3ug/ml rshh, rshh-重組人 shh 蛋白，r&d 公司）、阻斷劑干預組（3ug/ml rshh+20um cyclopamine, cyclopamine環(huán)杷明, 美國 sigma 公司）。在 24 孔培養(yǎng)板內(nèi)加入 250 l matrigel (bd, usa)37c 孵育 1 小時形成膠體，聚合凝膠后將各組 rf/6a 細胞按 4104 接種至小孔中。每組 三孔，1% fbs ，dmem 及 200 mol/l cocl2 孵育，12 小時后利用倒置相差顯微鏡觀察 matrigel 膠上二維血管管腔形成的情況。每孔隨機選擇 5 個視野，每組實驗重復三次。adobe photoshop 7.0 計算新生血管管腔長度，并用每孔每個視野下血管管腔平均總長度(mm)表示。1.8 統(tǒng)計學分析所有數(shù)據(jù)以平均值士標準差（sd）或平均值士標準誤（se）表示。采用單因素方差分 析檢驗(anova) ，mann-whitney u test 以及 independent-samples t-test。顯著性檢驗標準為 p0.05。利用 spss for windows l30 軟件(spss inc., usa)進行統(tǒng)計學分析。2結(jié)果2.1 細胞培養(yǎng)及鑒定培養(yǎng)的 rf/6a 細胞和血管性血友病因子免疫染色鑒定,胞漿被 tritc 結(jié)合二抗染成紅色(圖 1)。160165170圖1 培養(yǎng)的rf/6a 細胞和細胞鑒定。a：亞融合狀態(tài)的rf/6a 細胞 (200); b:培養(yǎng)的rf/6a細胞血管性血 友病因子免疫熒光染色(400)。fig. 1 cultured rf/6a cells and cell identification. a: subconfluent rf/6a cells (original magnification 200); b: immunofluorescent staining for von willebrand factor in cultured rf/6a cells. (original magnification 400).2.2 體外不同缺氧時間下 rf/6a 細胞中 shh 信號通路（ptch1、gli1）及相 關(guān)調(diào)控基因（dll4、hes1、hdf-1）mrna 的時程表達規(guī)律。實時定量 pcr 結(jié)果顯示：ptch1 mrna 表達隨低氧時間的延長逐漸升高，gli1、dll4,、 hes1 的 mrna 表達于 12 小時達到最高值，并持續(xù)高表達至 24 小時。hif-1mrna 表達在 低氧 6 小時達到最高峰；（圖 2）5.0relative mrna expression(normalized to hypoxic time 0 hour)4.54.03.53.02.52.01.5ptch1gli1dll4hes1hif-11.00.50.06h 12h24hhypoxia time (hour)175注：低氧 0 小時的 mrna 表達水平作為參照，其值設為 1，見圓點線條所示。圖2 缺氧不同時間下rf/6a 細胞ptch1、gli1、dll4,、hes1、hif-1 mrna表達定量分析fig. 2 expression of the ptch1、gli1、dll4,、hes1、hif-1 mrna in rf/6a cells at different times.1802.3 shh 信號通路的激動劑和阻滯劑對相關(guān)調(diào)控基因（ptch1、gli1、dll4）mrna 和蛋白表達水平的影響。激動劑 rshh 能促進 shh 信號受體及下游相關(guān)調(diào)控基因 mrna 表達，阻斷劑 cyclopamine 則能減少 shh 信號受體及下游相關(guān)調(diào)控基因 mrna 表達，其差異有統(tǒng)計學意義（p 0.05） (圖 3)。western blot 結(jié)果與 real-time quantitative pcr 定量分析結(jié)果相符（圖 4）。blankpbsrshhrshh+cyclopaminerelative mrna expression(normalized to hypoxic time 0 hour)16.014.0*12.0*10.08.0*6.0*4.0*2.00.0ptch1gli1 dll4185190195圖 3 不同干預組對低氧條件下 rf/6a 細胞 ptch1、gli1、dll4 mrna 表達的影響。, p 0.05 與空白對 照組比較；*, p 0.05 與 rshh 組比較。fig. 3 mrna expression of ptch1, gli1 and dll4 in hypoxic rf/6a of different treatment groups. , p0.05 versus blank control. *, p 0.05 versus rshh alone.圖 4 不同干預組對低氧條件下 rf/6a 細胞 ptch1、gli1、dll4 蛋白表達的影響。1：空白對照組；2： pbs 對照組；3：rshh 組；4：rshh + cyclopamine 組。fig. 4 protein expression of ptch1, gli1 and dll4 in hypoxic rf/6a of different treatment groups. note:1:blank group; 2: pbs group; 3: rshh group; 4: rshh + cyclopamine group.2.4 shh 信號通路的激動劑和阻滯劑對缺氧下 rf/6a 細胞周期進程的影響。細胞周期分析表明：相對于空白對照組，rshh 組阻滯在 s 期的細胞比例明顯增多，其 差異具有統(tǒng)計學意義。（圖 5）blank pbs rs hh rs hh+cyclopamine100rf/6a cell cycle distribution806040 *200go/g1 s g2/mstage200205圖5 不同干預組對低氧條件下rf/6a 細胞周期的影響。, p 0.05與空白組對照；*, p 0.05與rshh組比較。fig.5 effect on the cell-cycle progression of hypoxic rf/6a cells in different treatment groups. , p 0.05versus blank control. *, p 0.05 versus rshh alone.2.5 shh 信號通路的激動劑和阻滯劑對缺氧下 rf/6a 細胞遷移的影響。細胞遷移實驗結(jié)果顯示：激動劑 rshh 能顯著性促進低氧條件脈絡膜微血管內(nèi)皮細胞遷 移，阻斷劑 cyclopamine 則顯著性抑制其遷移（圖 6）。100 *90number of migrated cells807060 *50403020100blank p bs rshh rshhgroups+c yclopamine 210圖6 不同干預組對低氧條件下rf/6a 細胞遷移的影響。, p 0.05與空白組對照；*, p 0.05與rshh組比較。fig.6 effect on the migration of hypoxic rf/6a cells in different treatment groups. , p 0.05 versus blankcontrol. *, p 0.05 versus rshh alone.2152202252302.6 shh 信號通路的激動劑和阻滯劑對缺氧下 rf/6a 細胞血管管腔形成的影 響。缺氧 12 小時各組 rf/6a 細胞血管管腔形成情況 (圖 7a,b,c,d)。用平均總血管長度表 示二維血管管腔形成情況，激動劑 rshh 導致 matrigel 內(nèi)形成多而密集的網(wǎng)狀血管結(jié)構(gòu)，而 空白對照組形成不完整的稀疏血管網(wǎng)絡。a: pbs groupb: rshh groupc: rshh + cyclopamine groupbar = 50 umd:6*54*32tube length , mm12350blank pbs rshhrshh+cyclopaminegroups240圖 7 不同干預組對低氧條件下 rf/6a 細胞血管管腔形成的影響。a,b,c 分別為 pbs 液對照組、3ug/ml rshh組、3ug/ml rshh+20um cyclopamine 組的血管管腔形成實驗的代表性圖片。d 為各組低氧條件下 rf/6a 細 胞血管管腔形成的長度變化。, p 0.05 與空白組對照；*, p 0.05 與 rshh 組比較。fig.7 effect on the tube formation of hypoxic rf/6a cells in different treatment groups. reprresentative photographs of each group are shown. a: pbs group;b: 3ug/ml rshh group;c: 3ug/ml rshh+20um cyclopaminegroup. d: the tube length of hypoxic rf/6a cells in each group., p 0.05 versus blank control. *, p 0.05versus rshh alone.2452502552603討論shh 信號通路調(diào)控血管新生主要通過 shh-ptch-smo-gli1 級聯(lián)反應實現(xiàn)的。sonic hedgehog 效應細胞膜上有兩種受體，即 ptch 和 smo。在缺少 shh 時，ptch 和 smo 相互作 用來抑制下游信號傳導；當 shh 存在時，shh 連接到 ptch 和 smo 的復合物受體上，ptch 和 smo 解離，活化的 smo 將信號傳到細胞內(nèi)，激活細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，即 gli 基因家族，激 活的 gli 進而轉(zhuǎn)錄激活下游靶基因。gli1 被認為是 shh 信號通路中目的基因激活的標記物。 研究已證實，shh 信號通路在血管新生特別在缺血或低氧損傷組織的血管新生中發(fā)揮著重要 作用，缺血后肢新生血管模型、小鼠傷口愈合模型和角膜新生血管模型中均可檢測到 shh 信號通路的表達9,10,11,12。hif-1-vegf-dll4 信號通路在缺氧下血管新生中亦起重要作用。shh 信號與缺氧調(diào)節(jié) 基因 hif-1、vegf 以及 dll4 之間的關(guān)系已被證明12,13。本實驗的結(jié)果表明在缺氧損傷 組織的血管新生中起關(guān)鍵作用的 shh 信號通路同樣參與了實驗性脈絡膜新生血管的形成，且 調(diào)控機制與起核心作用的 hif-1 -vegf-dll4 信號通路有關(guān)。shh 信號通路通過調(diào)節(jié)下游 hif-1-vegf-dll4 通路來促進 cnv 形成。環(huán)杷明（cyclopamine）是一種來源于藜蘆屬植物的甾體生物堿。它能與 shh 信號通路 中的 smo 結(jié)合，改變 smo 的空間構(gòu)象，失去活性的 smo 進而抑制 shh 信號通路下游的信號 傳導。在大鼠堿燒傷所致的角膜新生血管模型和小鼠病理性視網(wǎng)膜血管新生模型的研究中 14，環(huán)杷明作為 shh 信號通路特異性的阻斷劑，均證實有明顯抑制新生血管形成的作用。本實驗的結(jié)果顯示環(huán)杷明作為 shh 信號通路的阻斷劑可抑制缺氧條件下脈絡膜血管內(nèi) 皮細胞增殖、遷移以及血管管腔形成。環(huán)杷明可拮抗內(nèi)源性 shh，下調(diào) gli1 表達的同時，265270也下調(diào) dll4 的表達水平，這提示 shh-gli1 可能作為 hif-1-vegf-dll4 級聯(lián)反應的交互信號，共同參與了實驗性 cnv 的形成。4結(jié)論研究結(jié)果表明 shh 信號通路可通過調(diào)節(jié)交互的 hif-1-vegf-dll4 信號通路來參與 cnv 發(fā)生發(fā)展。shh 信號通路的阻斷劑可抑制缺氧條件下脈絡膜血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移 以及血管管腔形成。選擇性調(diào)節(jié) shh 信號可能是 cnv 治療的新途徑。參考文獻 (references)2752802852902951 friedman ds,ocolmain bj,munoz b.prevalence of age-related macular degeneration in the unitedstatesj.arch ophthalmol,2004,122(4):564-572.2 bressler nm,bressler sb.age-related macular degenarationj.surv ophthalmol,1988,32(6):375-413.3 starita c.hydrodynamics of ageing brchs membrane:implications for macular diseasej.exp eyeres,1996,62(5):565-572.4 feigl b.age-related maculopathy in the light of ischaemiaj.clin exp optom,2007,90(4):263-271.5 pola r,ling le.the morphogen sonic hedgehog is an in direct angiogenic agent upregulating two families of angiogenic