疫組織化學染色sp技術.pptVIP

武漢大學病理教研室,免疫組織化學技術的定義,免疫組織化學技術(Immunohistochemistry, IHC)是用標記的特異性抗體（或抗原）對組織內的抗原（或抗體）的分布進行定位、定性、定量檢測，經過組織化學呈色反應在組織原位顯示抗原（或抗體），如各種蛋白質、多肽、磷脂和多糖等成分的一門新技術。,武漢大學病理教研室,免疫組織化學的應用,IHC通過檢測細胞內、細胞表面或細胞間的正?；虍惓５奈镔|，以研究組織細胞的正常生理、代謝及疾病的病因、發(fā)病機理，廣泛用于各種蛋白質或肽類物質表達水平的檢測，細胞屬性的判定、淋巴細胞的免疫表型分析、細胞增殖和凋亡的研究，以及細胞周期和信號轉導的研究等。,武漢大學病理教研室,實驗名稱,鏈霉菌親和素-過氧化物酶連結法 (Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method, 簡稱S-P法) 檢測胃癌組織CKVimentin的蛋白表達,武漢大學病理教研室,S-P法原理示意圖,過氧化物酶,鏈酶親和素,生物素,生物素化二抗,特異性一抗,待測抗原,武漢大學病理教研室,免疫組織化學基本實驗流程,武漢大學病理教研室,具體步驟如下： 1石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精水化，以0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 2所有組織均采用微波修復抗原； 3室溫冷卻后，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 4滴加50l過氧化物酶阻斷液（試劑A），37濕盒孵育 10min； 50.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 6滴加非免疫性動物血清（試劑B），37濕盒孵育 10min；,武漢大學病理教研室,7甩去多余血清，分別滴加種抗體，4濕盒孵育 過夜，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 8滴加生物素標記的二抗（試劑C），37濕盒孵育 15min，0.01M PBS（pH 7.4）漂洗35min； 9滴加鏈親和素-過氧化物酶溶液（試劑D），37濕盒孵育 15min，甩去多余液體； 10每片滴加新鮮配制的二甲基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液，光鏡下控制反應時間（約為1-5min），自來水充分沖洗，蘇木素復染； 11常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片并鏡檢分析； 12陽性對照采用已知陽性片為標準，陰性對照采用PBS取代第一抗體，其余步驟相同。,武漢大學病理教研室,實驗流程中的注意事項,內源性過氧化物酶的滅活 血清封閉 沖洗 抗體選擇及一抗孵育時間 檢測及顯色系統(tǒng) 復染,武漢大學病理教研室,染色前處理 取材、脫水、浸蠟,組織及時固定 固定劑選擇：10%中性緩沖福爾馬林 4%多聚甲醛 常規(guī)下固定8-24小時 取材厚度：2mm,武漢大學病理教研室,染色前處理 預防脫片,常選用多聚耐氨酸（poly-L-lysine） 注意：1）應嚴格控制使用次數(shù) 2）玻片潔凈度,武漢大學病理教研室,染色前處理 包埋與切片,包埋：選擇低熔點石蠟，溫度不超過62 切片：厚度 3-4m 烤片：溫度60，時間1小時；或602小時（邁新）；或60過夜,武漢大學病理教研室,染色前處理 切片保存,切片不宜長時間在常溫下保存,武漢大學病理教研室,染色前處理 脫臘,原則：免疫組化的脫蠟試劑應與常規(guī)HE 脫蠟分開,武漢大學病理教研室,實驗操作中的應用,抗原修復 實驗操作中的注意事項,武漢大學病理教研室,抗原修復,影響染色結果的最關鍵因素 抗原修復方法分類 1）酶消化法 2）加熱法（高壓法水煮法微波法） 抗原修復液的選擇 1）檸檬酸鹽緩沖液（PH 7.2-7.4） 2）Tris（PH 7-8） 3） EDTA（PH 8.0）,武漢大學病理教研室,內源性過氧化物酶的滅活,存在部位：紅細胞、橫紋肌細胞、粒細胞、 單核細胞、肝細胞及腎細胞 消除方法：3% H2O2 浸泡10分鐘,武漢大學病理教研室,血清封閉,目的：減少非特異性著色 時間：一般在加載一抗之前使用,武漢大學病理教研室,沖 洗,一般采用PBS（PH 7.4-7.6）充分沖洗 增加效果 可加入Tween20,武漢大學病理教研室,一抗孵育時間及抗體選擇,應選擇信譽高、質量好的試劑公司 抗體切忌反復凍融 一抗為濃縮液時，需選擇最佳稀釋濃度 按說明書可采用 37 1-2 小時或 4 冰箱過夜,武漢大學病理教研室,檢測及顯色系統(tǒng),一般采用以生物素標記的辣根過氧化物酶為基礎的檢測方法。如SP、LSABC、ABC等 顯色方法：經常采用辣根過氧化物酶系統(tǒng)檢測,武漢大學病理教研室,顯色系統(tǒng),常用的酶 1.辣根過氧化物酶(HRP) A:顯色底物DAB-棕黃色 敏感度高、定位清晰、易于觀察、保存 B:顯色底物AEC-磚紅色 2.堿性磷酸酶(AP) 顯色底物:BCIP/NBT-藍紫色,武漢大學病理教研室,復 染,原則：注意兩者之間對比，突出陽性信號,武漢大學病理教研室,實驗對照設計,原則：所有檢測指標均設陽性對照、陰性對照,武漢大學病理教研室,結果分析,1.特定的定位 胞膜型、胞漿型、全漿型或胞核型，局限性或彌散性。 2.染色的不均一性 陽性切片的染色應分布不均，