GB15193.16-2014食品安全國家標準毒物動力學試驗.pdf

書 書 書中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準犌犅 食品安全國家標準毒物動力學試驗 發(fā)布 實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā) 布書 書 書犌犅 前言本標準代替 代謝試驗 。本標準與 相比，主要修改如下： 標準名稱修改為“食品安全國家標準毒物動力學試驗” ； 修改了范圍； 增加了術語和定義； 修改了試驗目的和原理； 修改了儀器和試劑； 增加了試驗方法； 刪除了生物轉化； 刪除了同位素實驗中的注意事項； 刪除了對生物樣品中受試物分析方法的要求； 刪除了結果判定； 增加了數(shù)據(jù)處理和結果評價； 增加了試驗報告； 增加了試驗的解釋。犌犅 食品安全國家標準毒物動力學試驗范圍本標準規(guī)定了毒物動力學試驗的基本試驗方法和技術要求。本標準適用于評價受試物的毒物動力學過程。術語和定義 受試物用于測試的物品，專指符合毒物動力學試驗要求的供試品。 毒物動力學受試物在體內吸收、分布、生物轉化和排泄等過程隨時間變化的動態(tài)特性。 吸收受試物從給予部位通常是機體的外表面或內表面的生物膜轉運至血循環(huán)的過程。 分布受試物通過吸收進入血液和體液后在體內循環(huán)和分配的過程。 代謝受試物在體內經(jīng)酶促或非酶促反應，結構發(fā)生改變的過程。 排泄受試物和（或）其代謝物從身體被清除過程。 生物利用度受試物被機體吸收利用的程度。 速率過程經(jīng)毒物動力學過程受試物的量在單位時間內的變化率，一般用單位時間過程進行的變化量表示過程的速率。毒物動力學的速率過程包括零級、一級和非線性種類型。 濃度時間曲線以給予受試物后時間為橫坐標，以受試物的血液濃度為縱坐標所作的算術坐標圖，反映受試物在體內的處置狀態(tài)、受試物含量的經(jīng)時變化和速率，該曲線下的面積反映了進入體循環(huán)的受試物含量。犌犅 表觀分布容積當體內受試物分布達動態(tài)平衡后，假設體內流體中的受試物濃度均一地與血漿中的受試物濃度一樣，這樣溶解體內受試物量所需的流體容積就是表觀分布容積。它以體內受試物量與血漿受試物濃度的比值表示。 機體總清除率受試物通過代謝和（或）排泄的方式從體內清除的速度；即單位時間內受試物從體內清除的表觀分布容積的分數(shù)。 消除半衰期體內血中受試物濃度下降一半所需要的時間，它是表示受試物消除速率的參數(shù)。 峰濃度受試物給予后血中能夠達到的最大濃度。 峰時間受試物給予后達到最大血濃度的時間。試驗目的和原理對一組或幾組試驗動物分別通過適當?shù)耐緩揭淮位蛟谝?guī)定的時間內多次給予受試物。然后測定體液、臟器、組織、排泄物中受試物和（或）其代謝產(chǎn)物的量或濃度的經(jīng)時變化。進而求出有關的毒物動力學參數(shù)，探討其毒理學意義。儀器和試劑 根據(jù)試驗需要，配備紫外分光光度計、熒光分光光度計、薄層層析儀、氣相色譜儀、高效液相色譜儀、氣質或液質聯(lián)用儀等設備。 放射性測量儀器。 實驗室常用儀器與試劑。試驗方法 受試物的基本信息應提供受試物的名稱、號、批號、來源、純度、性狀、理化性質、儲存條件及配制方法等有關資料。 實驗動物 動物種、系的選擇實驗動物的選擇應符合 和 的有關規(guī)定。盡可能選用與其他毒理學試驗相同的種、系，并能出現(xiàn)受試物的典型毒作用的動物。一般首選大鼠，周齡一般為周 周，但若有證犌犅 據(jù)證明其代謝途徑與人類接近，應選擇相應的動物。一般應選用年輕、健康的成年動物。選用嚙齒類動物時，試驗開始時動物體重的差異不應超過平均體重的 。選擇其他動物應說明其理由。 性別和數(shù)量對實驗動物的性別不作特殊規(guī)定，如毒理學研究表明毒性有明顯的性別差異時，應設不同的性別組。一般情況下，雌性動物應選用未產(chǎn)過仔和非妊娠的；每一試驗組不應少于只動物，在非嚙齒類動物的試驗中，動物數(shù)量可酌情減少。 動物飼養(yǎng)試驗前動物在實驗動物房至少應進行環(huán)境適應和檢疫觀察。實驗動物飼養(yǎng)條件、飲用水、飼料應符合國家標準和有關規(guī)定（實驗動物飼養(yǎng)條件應符合 、飲用水應符合 、飼料應符合 的有關規(guī)定） 。 劑量試驗中至少需要選用兩個劑量水平，每個劑量水平應使其受試物或受試物的代謝產(chǎn)物足以在排泄物中測出。劑量設置時應充分考慮現(xiàn)有的毒理學資料所提供的信息。如果缺乏相應的毒理學資料，則高劑量水平應低于 ，或低于急性毒性劑量范圍的較低值。低劑量水平應該是高劑量水平的一部分。如果試驗中僅設置一個劑量水平，該劑量理論上應使其受試物或受試物的代謝產(chǎn)物足以在排泄物中測出，并不產(chǎn)生明顯的毒性，同時應提供合理的理由說明不設置兩個劑量水平的原因。 試驗步驟和觀察指標 受試物的準備受試物的純度不應低于 。試驗可采用“未標記的”或“標記”受試物。如果使用放射性同位素標記的受試物，其放射化學純度不應低于 ，且應將放射性同位素標記在受試物分子的骨架上或具有重要功能的基團上。 受試物給予途徑當選用溶媒或其他介質時，受試物應充分溶解或均勻懸浮其中，所選溶媒或介質對受試物毒物動力學不產(chǎn)生任何影響。一般采用灌胃的途徑，某些情況下還可以采用吞服膠囊、摻入飼料的方式給予受試物。采用靜脈注射給予受試物，應選擇合適的注射部位和注射量給予受試物，所選溶媒或介質應不影響血液的完整性或血流量。 生物樣品分析方法的建立和確證 由于生物樣品一般來自全血、血清、血漿、尿液、器官或組織等，具有取樣量少、受試物濃度低、干擾物質多以及個體差異大等特點，因此必須根據(jù)受試物的結構、生物介質和預期的濃度范圍，建立靈敏、特異、精確、可靠的生物樣品定量分析方法，并對方法進行確證。 生物樣品分析方法有：）色譜法：氣相色譜法（） 、高效液相色譜法（） 、色譜質譜聯(lián)用法（ 、 ， ， ） ，生物樣品分析一般首選色譜法；）免疫學方法：放射免疫分析法、酶免疫分析法、熒光免疫分析法等；犌犅 ）微生物學方法；）同位素示蹤法。對方法進行確證一般應進行以下幾方面的考察：）特異性：必須證明待測物是預期的分析物，內源性物質和其他代謝物不得干擾樣品的測定。對于色譜法至少要分析個不同個體空白生物樣品色譜圖、空白生物樣品外加對照物質色譜圖及給予受試物后的生物樣品色譜圖。）標準曲線與定量范圍：根據(jù)待測物的濃度與響應的相關性，用回歸分析方法（如用加權最小二乘法）獲得標準曲線。標準曲線高低濃度范圍為定量范圍，在定量范圍內濃度測定結果應達到試驗要求的精密度和準確度。）精密度與準確度：要求選擇個不同濃度的質控樣品同時進行方法的精密度和準確度的考察。低濃度選擇在定量下限附近，其濃度在定量下限的倍以內；高濃度接近于標準曲線的上限；中間選一個濃度。）定量下限：定量下限是標準曲線上的最低濃度點，要求至少能滿足測定個個消除半衰期時樣品中的受試物濃度，或峰濃度的 時的受試物濃度，其準確度應在真實濃度的 范圍內，批內和批間相對標準差應小于 。）樣品穩(wěn)定性：根據(jù)具體情況，對含受試物的生物樣品在室溫、冰凍或凍融條件下以及不同存放時間進行穩(wěn)定性考察，以確定生物樣品的存放條件和時間。還應注意儲備液的穩(wěn)定性以及樣品處理后的溶液中分析物的穩(wěn)定性。）提取回收率：應考察高、中、低個濃度的提取回收率，其結果應精密和可重現(xiàn)。 觀察指標 血中受試物濃度時間曲線 受試動物數(shù)動物給予受試物后選擇個 個不同的時間點采血，每個時間點的動物數(shù)不應少于只。最好從同一動物個體多次取樣。如由多只動物的數(shù)據(jù)共同構成一條血中受試物濃度時間曲線，應相應增加動物數(shù)，以反映個體差異對試驗結果的影響。 采樣點給予受試物前需要采血作為空白樣品。為獲得給予受試物后的一個完整的血中受試物濃度時間曲線，采樣時間點的設計應兼顧受試物的吸收相、分布相（峰濃度附近）和消除相。整個采樣時間至少應持續(xù)到個個消除半衰期，或持續(xù)到血中受試物濃度為峰濃度的 。 毒物動力學參數(shù)根據(jù)試驗中測得的各受試動物的血中受試物濃度時間數(shù)據(jù)，求得受試物的主要毒物動力學參數(shù)。靜脈注射給予受試物，應提供消除半衰期、表觀分布容積、曲線下面積、機體總清除率等參數(shù)值；血管外給予受試物，除提供上述參數(shù)外，尚應提供峰濃度和峰時間等參數(shù)，以反映受試物吸收的規(guī)律。 單次給予受試物單次給予不同劑量的受試物（或其放射性同位素標記物）后，于不同時間測定血漿或全血中受試物濃度（或總放射活性強度） ，提供各個受試動物的血中受試物濃度時間數(shù)據(jù)和曲線及其平均值、標準差及其曲線；各個受試動物的主要毒物動力學參數(shù)及平均值、標準差。犌犅 重復多次給予受試物重復多次給予受試物，應結合單次試驗進行，一般選取一個劑量多次給予受試物，至少提供次穩(wěn)態(tài)的受試物的谷濃度，達穩(wěn)態(tài)后進行末次給予受試物試驗。于不同時間測定血漿或全血中受試物濃度或總放射活性強度，與單次給予受試物相比，確定重復多次給予受試物時的毒物動力學特征。 吸收受試物吸收的程度和速率取決于受試物的給予途徑。一般認為靜脈注射給予受試物時母體化學物的瞬時吸收率計為 ，經(jīng)口給予受試物時應確定達峰濃度、達峰時間和曲線下面積。分析母體化學物濃度與時間變化曲線可以確定經(jīng)口給予受試物的吸收常數(shù)。生物利用度為經(jīng)口給予受試物的曲線下面積與靜脈注射曲線下面積的比值。 分布選擇合適的受試物劑量給予實驗動物后，根據(jù)受試物的理化性質和毒性特點測定其在血液、心、肝、脾、肺、腎、胃腸道、生殖腺、腦、體脂、骨骼肌等組織的濃度，以了解受試物在體內的主要分布器官組織。特別關注受試物濃度高、蓄積時間長的組織和器官，以及在毒性靶器官的分布。參考血中受試物濃度時間曲線的變化趨勢，選擇至少個時間點分別代表吸收相、分布相和消除相的受試物分布。若某組織的受試物濃度較高，應增加觀測點，進一步研究該組織中受試物消除的情況。每個時間點，至少應有個動物的數(shù)據(jù)。進行組織分布試驗，應注意取樣的代表性和一致性。同位素標記物的組織分布試驗，應提供標記受試物的放射化學純度、標記率（比活性） 、標記位置、給予受試物劑量等參數(shù)；提供放射性測定所采用的詳細方法；提供采用放射性示蹤生物學試驗的詳細過程，以及在生物樣品測定時對放射性衰變所進行的校正方程等。在試驗條件允許的情況下，盡可能提供給予受試物后不同時相的整體放射自顯影圖像。 代謝應采用適當?shù)募夹g分析生物樣本，以確定受試物的代謝途徑和程度。應闡明代謝產(chǎn)物的結構。體外試驗也有助于獲取受試物代謝途徑方面的信息。 排泄在排泄試驗中，選定合適的劑量給予受試物后，按一定的時間間隔分段收集尿樣、糞便、呼出氣，測定受試物濃度，計算受試物經(jīng)此途徑排泄的速率及排泄量。必要時還應收集膽汁檢測經(jīng)此途徑排泄的速率及排泄量。在給予受試物劑量至少 已被消除、或在上述收集到的樣品中已檢測不到受試物、或檢測時間長達 ，可停止排泄物的收集。若呼出氣中受試物和（或）代謝產(chǎn)物濃度，可停止對動物呼出氣體的收集。記錄受試物自糞、尿、呼出氣等排泄的速率及總排泄量，提供受試物在動物體內的物質平衡的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)處理和結果評價根據(jù)具體的試驗類型，將數(shù)據(jù)匯總。選擇科學合理的數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學方法，并說明所用軟件的名稱、版本和來源。犌犅 試驗報告 試驗名稱、試驗單位名稱和聯(lián)系方式、報告編號。 試驗委托單位名稱和聯(lián)系方式、樣品受理日期。 試驗開始和結束日期、試驗項目負責人、試驗單位技術負責人、簽發(fā)日期。 試驗摘要。 受試物：名稱、批號、劑型、狀態(tài)（包括感官、性狀、包裝完整性、標識） 、數(shù)量、前處理方法、溶媒。 實驗動物：物種、品系、級別、數(shù)量、體重、性別、來源（供應商名稱、實驗動物生產(chǎn)許可證號） ，動物檢疫、適應情況，飼養(yǎng)環(huán)境（溫度、相對濕度、實驗動物設施使用許可證號） ，飼料來源（供應商名稱、實驗動物飼料生產(chǎn)許可證號） 。 試驗方法：試驗分組、每組動物數(shù)、劑量選擇依據(jù)、受試物給予途徑及期限、觀察指標、統(tǒng)計學方法。 試驗結果：）用表格形式匯集試驗數(shù)據(jù)，內容應包括不同劑量組每只動物的編號、性別、染毒劑量、體重、給予受試物前后生物材料中受試物及其代謝產(chǎn)物的測定值（或放射活性強度）等原始數(shù)據(jù)；）計算各劑量組上述測定值的均值及標準差；）繪制不同劑量條件下的受試物濃