GB5009.85-2016食品安全國家標準食品中維生素B2的測定.pdf

中 華 人 民 共 和 國 國 家 標 準G B5 0 0 9 .8 52 0 1 6食品安全國家標準食品中維生素B2的測定2 0 1 6 - 1 2 - 2 3發(fā)布2 0 1 7 - 0 6 - 2 3實施中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會國 家 食 品 藥 品 監(jiān) 督 管 理 總 局發(fā) 布G B5 0 0 9.8 52 0 1 6 前 言 本標準代替G B/T5 0 0 9.8 52 0 0 3 食品中核黃素的測定 、G B/T9 6 9 5.2 82 0 0 8 肉與肉制品 維生素B2含量測定 、G B/T7 6 2 92 0 0 8 谷物中維生素B2測定 和G B5 4 1 3.1 22 0 1 0 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B2的測定 。本標準與G B/T5 0 0 9.8 52 0 0 3相比, 主要變化如下: 標準名稱修改為“ 食品安全國家標準 食品中維生素B2的測定” ; 增加了高效液相色譜法; 刪除了微生物法。G B5 0 0 9.8 52 0 1 61 食品安全國家標準食品中維生素B2的測定1 范圍本標準規(guī)定了食品中維生素B2的測定方法。本標準第一法為高效液相色譜法, 第二法為熒光分光光度法, 適用于各類食品中維生素B2的測定。第一法 高效液相色譜法2 原理試樣在稀鹽酸環(huán)境中恒溫水解, 調(diào)p H至6.06.5, 用木瓜蛋白酶和高峰淀粉酶酶解, 定容過濾后,濾液經(jīng)反相色譜柱分離, 高效液相色譜熒光檢測器檢測, 外標法定量。3 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。3.1 試劑3.1.1 鹽酸(HC l) 。3.1.2 冰乙酸(CH3C OOH) 。3.1.3 氫氧化鈉(N a OH) 。3.1.4 三水乙酸鈉(CH3C OON a3 H2O) 。3.1.5 甲醇(CH3OH) : 色譜純。3.1.6 木瓜蛋白酶: 活力單位1 0U/m g。3.1.7 高峰淀粉酶: 活力單位1 0 0U/m g, 或性能相當者。3.2 試劑配制3.2.1 鹽酸溶液(0.1m o l/L) : 吸取9m L鹽酸, 用水稀釋并定容至10 0 0m L。3.2.2 鹽酸溶液(1+1) : 量取1 0 0m L鹽酸, 緩慢倒入1 0 0m L水中, 混勻。3.2.3 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 準確稱取4g氫氧化鈉, 加9 0m L水溶解, 冷卻后定容至1 0 0m L。3.2.4 乙酸鈉溶液(0.1 m o l/L) : 準確稱取1 3.6 0g三水乙酸鈉, 加9 0 0 m L水溶解, 用水定容至10 0 0m L。3.2.5 乙酸鈉溶液(0.0 5m o l/L) : 準確稱取6.8 0g三水乙酸鈉, 加9 0 0m L水溶解, 用冰乙酸調(diào)p H至4.05.0, 用水定容至10 0 0m L。3.2.6 混合酶溶液: 準確稱取2.3 4 5g木瓜蛋白酶和1.1 7 5g高峰淀粉酶, 加水溶解后定容至5 0m L。臨用前配制。G B5 0 0 9.8 52 0 1 62 3.2.7 鹽酸溶液(0.0 1 2m o l/L) : 吸取1m L鹽酸, 用水稀釋并定容至10 0 0m L。3.3 標準品維生素B2(C1 7H2 0N4O6,C A S號:8 3 - 8 8 - 5) : 純度9 8%。3.4 標準溶液配制3.4.1 維生素B2標準儲備液(1 0 0g/m L) : 將維生素B2標準品置于真空干燥器或裝有五氧化二磷的干燥器中干燥處理2 4h后, 準確稱取1 0m g( 精確至0.1m g) 維生素B2標準品, 加入2m L鹽酸溶液(1+1) 超聲溶解后, 立即用水轉(zhuǎn)移并定容至1 0 0m L?；靹蚝筠D(zhuǎn)移入棕色玻璃容器中, 在4冰箱中貯存, 保存期2個月。標準儲備液在使用前需要進行濃度校正, 校正方法參見附錄A。3.4.2 維生素B2標準中間液(2.0 0g/m L) : 準確吸取2.0 0m L維生素B2標準儲備液, 用水稀釋并定容至1 0 0m L。臨用前配制。3.4.3 維生素B2標準系列工作液: 分別吸取維生素B2標準中間液0.2 5 m L、0.5 0 m L、1.0 0 m L、2.5 0m L、5.0 0m L, 用水定容至1 0m L, 該標準系列濃度分別為0.0 5g/m L、0.1 0g/m L、0.2 0g/m L、0.5 0g/m L、1.0 0g/m L。臨用前配制。4 儀器和設(shè)備4.1 高效液相色譜儀: 帶熒光檢測器。4.2 天平: 感量為1m g和0.0 1m g。4.3 高壓滅菌鍋。4.4 p H計: 精度0.0 1。4.5 渦旋振蕩器。4.6 組織搗碎機。4.7 恒溫水浴鍋。4.8 干燥器。4.9 分光光度計。5 分析步驟5.1 試樣制備取樣品約5 0 0g, 用組織搗碎機充分打勻均質(zhì), 分裝入潔凈棕色磨口瓶中, 密封, 并做好標記, 避光存放備用。稱取2g 1 0g( 精確至0.0 1g) 均質(zhì)后的試樣( 試樣中維生素B2的含量大于5g) 于1 0 0m L具塞錐形瓶中, 加入6 0m L的0.1m o l/L鹽酸溶液, 充分搖勻, 塞好瓶塞。將錐形瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi), 在1 2 1下保持3 0m i n, 冷卻至室溫后取出。用1m o l/L氫氧化鈉溶液調(diào)p H至6.06.5, 加入2m L混合酶溶液, 搖勻后, 置于3 7培養(yǎng)箱或恒溫水浴鍋中過夜酶解。將酶解液轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 用濾紙過濾或離心, 取濾液或上清液, 過0.4 5m水相濾膜作為待測液。注:操作過程應避免強光照射。不加試樣, 按同一操作方法做空白試驗。5.2 儀器參考條件a) 色譜柱:C1 8柱, 柱長1 5 0mm, 內(nèi)徑4.6mm, 填料粒徑5m, 或相當者;G B5 0 0 9.8 52 0 1 63 b) 流動相: 乙酸鈉溶液(0.0 5m o l/L)-甲醇(6 53 5) ;c) 流速:1m L/m i n;d) 柱溫:3 0;e) 檢測波長: 激發(fā)波長4 6 2n m, 發(fā)射波長5 2 2n m;f) 進樣體積:2 0L。5.3 標準曲線的制作將標準系列工作液分別注入高效液相色譜儀中, 測定相應的峰面積, 以標準工作液的濃度為橫坐標, 以峰面積為縱坐標, 繪制標準曲線。5.4 試樣溶液的測定將試樣溶液注入高效液相色譜儀中, 得到相應的峰面積, 根據(jù)標準曲線得到待測液中維生素B2的濃度。5.5 空白試驗要求空白試驗溶液色譜圖中應不含待測組分峰或其他干擾峰。6 分析結(jié)果的表述試樣中維生素B2的含量按式(1) 計算:X=Vm1 0 010 0 0(1) 式中:X 試樣中維生素B2( 以核黃素計) 的含量, 單位為毫克每百克(m g/1 0 0g) ; 根據(jù)標準曲線計算得到的試樣中維生素B2的濃度, 單位為微克每毫升(g/m L) ;V 試樣溶液的最終定容體積, 單位為毫升(m L) ;m 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) ;1 0 0 換算為1 0 0克樣品中含量的換算系數(shù);10 0 0 將濃度單位g/m L換算為m g/m L的換算系數(shù)。結(jié)果保留三位有效數(shù)字。7 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 0%。8 其他當取樣量為1 0.0 0g時, 方法檢出限為0.0 2m g/1 0 0g, 定量限為0.0 5m g/1 0 0g。G B5 0 0 9.8 52 0 1 64 第二法 熒光分光光度法9 原理維生素B2在4 4 0n m5 0 0n m波長光照射下發(fā)生黃綠色熒光。在稀溶液中其熒光強度與維生素B2的濃度成正比。在波長5 2 5n m下測定其熒光強度。試液再加入連二亞硫酸鈉, 將維生素B2還原為無熒光的物質(zhì), 然后再測定試液中殘余熒光雜質(zhì)的熒光強度, 兩者之差即為試樣中維生素B2所產(chǎn)生的熒光強度。1 0 試劑和材料除非另有說明, 本方法所用試劑均為分析純, 水為G B/T6 6 8 2規(guī)定的一級水。1 0.1 試劑1 0.1.1 鹽酸(HC l) 。1 0.1.2 冰乙酸(CH3C OOH) 。1 0.1.3 氫氧化鈉(N a OH) 。1 0.1.4 三水乙酸鈉(CH3C OON a3 H2O) 。1 0.1.5 木瓜蛋白酶: 活力單位1 0U/m g。1 0.1.6 高峰淀粉酶: 活力單位1 0 0U/m g, 或性能相當者。1 0.1.7 硅鎂吸附劑:5 0m1 5 0m。1 0.1.8 丙酮(CH3C O CH3) 。1 0.1.9 高錳酸鉀(KM n O4) 。1 0.1.1 0 過氧化氫(H2O2) :3 0%。1 0.1.1 1 連二亞硫酸鈉(N a2S2O4) 。1 0.2 試劑配制1 0.2.1 鹽酸溶液(0.1m o l/L) : 吸取9m L鹽酸, 用水稀釋并定容至10 0 0m L。1 0.2.2 鹽酸溶液(1+1) : 量取1 0 0m L鹽酸, 緩慢倒入1 0 0m L水中, 混勻。1 0.2.3 乙酸鈉溶液(0.1 m o l/L) : 準確稱取1 3.6 0g三水乙酸鈉, 加9 0 0 m L水溶解, 用水定容至10 0 0m L。1 0.2.4 氫氧化鈉溶液(1m o l/L) : 準確稱取4g氫氧化鈉, 加9 0m L水溶解, 冷卻后定容至1 0 0m L。1 0.2.5 混合酶溶液: 準確稱取2.3 4 5g木瓜蛋白酶和1.1 7 5g高峰淀粉酶, 加水溶解后定容至5 0m L。臨用前配制。1 0.2.6 洗脫液: 丙酮-冰乙酸-水(5+2+9, 體積比) 。1 0.2.7 高錳酸鉀溶液(3 0g/L) : 準確稱取3g高錳酸鉀, 用水溶解后定容至1 0 0m L。1 0.2.8 過氧化氫溶液(3%) : 吸取1 0m L3 0%過氧化氫, 用水稀釋并定容至1 0 0m L。1 0.2.9 連二亞硫酸鈉溶液(2 0 0g/L) : 準確稱取2 0g連二亞硫酸鈉, 用水溶解后定容至1 0 0m L。此溶液用前配制, 保存在冰水浴中,4h內(nèi)有效。1 0.3 標準品維生素B2(C1 7H2 0N4O6,C A S號:8 3 - 8 8 - 5) : 純度9 8%。G B5 0 0 9.8 52 0 1 65 1 0.4 標準溶液配制1 0.4.1 維生素B2標準儲備液(1 0 0g/m L) : 將維生素B2標準品置于真空干燥器或裝有五氧化二磷的干燥器中干燥處理2 4h后, 準確稱取1 0m g( 精確至0.1m g) 維生素B2標準品, 加入2m L鹽酸溶液(1+1) 超聲溶解后, 立即用水轉(zhuǎn)移并定容至1 0 0m L。混勻后轉(zhuǎn)移入棕色玻璃容器中, 在4冰箱中貯存, 保存期2個月。標準儲備液在使用前需要進行濃度校正, 校正方法參見附錄A。1 0.4.2 維生素B2標準中間液(1 0g/m L) : 準確吸取1 0m L維生素B2標準儲備液, 用水稀釋并定容至1 0 0m L。在4冰箱中避光貯存, 保存期1個月。1 0.4.3 維生素B2標準使用溶液(1g/m L) : 準確吸取1 0m L維生素B2標準中間液, 用水定容至1 0 0m L。此溶液每毫升相當于1.0 0g維生素B2。在4冰箱中避光貯存, 保存期1周。1 1 儀器和設(shè)備1 1.1 熒光分光光度計。1 1.2 天平: 感量為1m g和0.0 1m g。1 1.3 高壓滅菌鍋。1 1.4 p H計: 精度0.0 1。1 1.5 渦旋振蕩器。1 1.6 組織搗碎機。1 1.7 恒溫水浴鍋。1 1.8 干燥器。1 1.9 維生素B2吸附柱。1 2 分析步驟1 2.1 試樣制備1 2.1.1 試樣的水解取樣品約5 0 0g, 用組織搗碎機充分打勻均質(zhì), 分裝入潔凈棕色磨口瓶中, 密封, 并做好標記, 避光存放備用。稱取2g 1 0g( 精確至0.0 1g, 約含1 0g 2 0 0g維生素B2) 均質(zhì)后的試樣于1 0 0m L具塞錐形瓶中, 加入6 0m L0.1m o l/L的鹽酸溶液, 充分搖勻, 塞好瓶塞。將錐形瓶放入高壓滅菌鍋內(nèi), 在1 2 1下保持3 0m i n, 冷卻至室溫后取出。用氫氧化鈉溶液調(diào)p H至6.06.5。1 2.1.2 試樣的酶解加入2m L混合酶溶液, 搖勻后, 置于3 7培養(yǎng)箱或恒溫水浴鍋中過夜酶解。1 2.1.3 過濾將上述酶解液轉(zhuǎn)移至1 0 0m L容量瓶中, 加水定容至刻度, 用干濾紙過濾備用。此提取液在4冰箱中可保存一周。注:操作過程應避免強光照射。1 2.2 氧化去雜質(zhì)視試樣中核黃素的含量取一定體積的試樣提取液( 約含1g1 0g維生素B2) 及維生素B2標準G B5 0 0 9.8 52 0 1 66 使用溶液分別置于2 0m L的帶蓋刻度試管中, 加水至1 5m L。各管加0.5m L冰乙酸, 混勻。加0.5m L3 0g/L高錳酸鉀溶液, 搖勻, 放置2m i n, 使氧化去雜質(zhì)。滴加3%過氧化氫溶液數(shù)滴, 直至高錳酸鉀的顏色褪去。劇烈振搖試管, 使多余的氧氣逸出。1 2.3 維生素B2的吸附和洗脫1 2.3.1 維生素B2吸附柱硅鎂吸附劑約1g用濕法裝入柱, 占柱長1/22/3( 約5c m) 為宜( 吸附柱下端用一小團脫脂棉墊上) , 勿使柱內(nèi)產(chǎn)生氣泡, 調(diào)節(jié)流速約為6 0滴/m i n。注:可使用等效商品柱。1 2.3.2 過柱與洗脫將全部氧化后的樣液及標準液通過吸附柱后, 用約2 0m L熱水淋洗樣液中的雜質(zhì)。然后用5m L洗脫液將試樣中維生素B2洗脫至1 0m L容量瓶中, 再用3m L4m L水洗吸附柱, 洗出液合并至容量瓶中, 并用水定容至刻度, 混勻后待測定。1 2.4 標準曲線的制備分別精確吸取維生素B2標準使用液0.3m L、0.6m L、0.9m L、1.2 5m L、2.5m L、5.0m L、1 0.0m L、2 0.0m L( 相當于0.3g、0.6g、0.9g、1.2 5g、2.5g、5.0g、1 0.0g、2 0.0g維生素B2) 或取與試樣含量相近的單點標準按1 2.2和1 2.3操作。1 2.5 試樣溶液的測定于激發(fā)光波長4 4 0n m, 發(fā)射光波長5 2 5n m, 測量試樣管及標準管的熒光值。待試樣管及標準管的熒光值測量后, 在各管的剩余液( 約5m L7m L) 中加0.1m L2 0%連二亞硫酸鈉溶液, 立即混勻, 在2 0s內(nèi)測出各管的熒光值, 作各自的空白值。1 3 分析結(jié)果的表述試樣中維生素B2的含量按式(2) 計算:X=(A-B)S(C-D)mf1 0 010 0 0(2) 式中:X 試樣中維生素B2( 以核黃素計) 的含量, 單位為毫克每百克(m g/1 0 0g) ;A 試樣管的熒光值;B 試樣管空白熒光值;S 標準管中維生素B2的質(zhì)量, 單位為微克(g) ;C 標準管的熒光值;D 標準管空白熒光值;m 試樣質(zhì)量, 單位為克(g) ;f 稀釋倍數(shù);1 0 0 換算為1 0 0克樣品中含量的換算系數(shù);10 0 0 將濃度單位g/1 0 0g換算為m g/1 0 0g的換算系數(shù)。計算結(jié)果保留至小數(shù)點后兩位。G B5 0 0 9.8 52 0 1 67 1 4 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的1 0%。1