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第二章工業(yè)微生物基礎(chǔ),1、微生物的特點 2、常見的工業(yè)微生物 3、工業(yè)微生物菌種的分離和選育 4、工業(yè)微生物菌種的改良 5、工業(yè)微生物菌種的保藏 6、工業(yè)微生物菌種的擴大培養(yǎng),教 學 內(nèi) 容,重點內(nèi)容,一、微生物的特點,1、種類多，分布廣 2、高面積-體積比，代謝能力強 3、生長迅速，繁殖快 4、適應(yīng)性強，容易培養(yǎng) 5、易變性,二、常見的工業(yè)微生物,微生物指是指那些個體微小，結(jié)構(gòu)簡單，必須借助顯微鏡的幫助才能看清它們外形的一群微小生物。,廣義的微生物包括病毒、立克次氏體、細菌、放線菌、酵母菌、霉菌、單細胞藻類、原生動物和支原體等。在發(fā)酵工業(yè)中經(jīng)常遇到的是細菌、放線菌、酵母菌、霉菌及危害、放線菌生長的噬菌體。,1、細菌,芽孢：某些細菌在其生長發(fā)育后期，可在細胞內(nèi) 形成一個圓形或橢圓形的抗逆性休眠體。 抗熱、抗輻射、抗化學物質(zhì)。如熱解糖梭菌的營養(yǎng)細胞在50度下經(jīng)短時間即被殺死，而它的一群芽孢在132度下經(jīng)4分多鐘才能殺死其中的50%。,2、放線菌,屬原核單細胞生物，有球菌、桿菌和螺旋菌三類，分革蘭氏陽性菌和陰性菌。在發(fā)酵專業(yè)中常用的是桿菌，它易形成芽孢。,屬原核生物，菌落呈放射狀，廣泛存在于泥土中，最大經(jīng)濟價值是用來生產(chǎn)抗生素。,3、霉菌,4、酵母菌,屬真核生物，俗稱絲狀真菌。在發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品和皮革等方面有重要用途，但易引起工業(yè)原料、產(chǎn)品和農(nóng)副產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)。,屬真核單細胞生物，主要生長在偏酸含糖量較高的環(huán)境中，中酒精、飲料等生產(chǎn)中有重要用途。,5、噬菌體,噬菌體侵染細菌過程課件欣賞,三、工業(yè)上常用的微生物及用途,列表超級鏈接,問題：在發(fā)酵生產(chǎn)中，哪些是工業(yè)上常用的微生物？,是一種感染原核生物的病毒。分烈性噬菌體和溫和噬菌體。能嚴重危害發(fā)酵生產(chǎn)。,四、工業(yè)微生物菌種的分離和選育,地點 方法,目的 方法,方法,方法,育種,（二）選育 1、選育的目的 就是要改善菌種的特性，使能提高產(chǎn)量、改進質(zhì)量、降低成本、改革工藝、 方便管理及綜合利用等。 2、基本方法 自然選育、生產(chǎn)育種、抗噬菌體菌株的選育、誘變育種、代謝控制育種及原生 質(zhì)體技術(shù)和體外重組DNA技術(shù)（基因工程）等。,缺點：產(chǎn)量低、副產(chǎn)物多、生產(chǎn)周期長。,菌種選育就是按照生產(chǎn)的要求，根據(jù)微生物的遺傳和變異的理論，用人工方法造成菌種變異，再經(jīng)過篩選而達到菌種選育的目的。,野生型菌株、變異菌株、菌種選育,名詞,原生質(zhì)體融合基本過程示意圖,誘變育種一般采用物理、化學誘變因素使微生物DNA的堿基排列發(fā)生變化，以使排列錯誤的DNA模板形成異常的遺傳信息，造成某些蛋白結(jié)構(gòu)變異，而使細胞的功能發(fā)生改變。 （此為較傳統(tǒng)的方法P16） 代謝控制育種主要有兩個方面：一方面是改變代謝通路的育種，另一方面改變代謝自動調(diào)節(jié)系統(tǒng)的育種。 有關(guān)育種的方法在微生物學中已詳細介紹，這里不再贅述。,原生質(zhì)體融合基本過程示意圖 P19,細胞壁,細胞壁溶解,細胞膜,營養(yǎng)細胞,原生質(zhì)體,原生質(zhì)體融合,融合細胞,原生質(zhì)體融合,原生質(zhì)體形成,細胞壁再生,原生質(zhì)體？ P18,名詞,五、工業(yè)微生物菌種的保藏,1、菌種保藏的目的 使菌種的生命得以延續(xù)并保持它們原有的生物學特性。 在基礎(chǔ)的研究中，可保證同一菌種在工作過程及工作結(jié)束后，均可獲得重復的實驗結(jié)果。 對于有經(jīng)濟價值的生產(chǎn)菌，良好的保藏條件可保持其高產(chǎn)、高抗性等優(yōu)良的性能。 對于通過生物工程技術(shù)所得的重組菌，則需保持其遺傳特性的穩(wěn)定。,2、菌種保藏的基本原理 使根據(jù)微生物生理、生化特點，人工地創(chuàng)造條件，使微生物處于代謝不活潑、 生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài) 。 這些人工造成的環(huán)境主要是低溫、干燥、缺氧三方面，使菌株盡可能少發(fā)生突變， 以達到保持純種的目的。 。,3、菌種保藏的具體方法 斜面保藏法和穿刺保藏法 干燥保藏法 懸液保藏法 冷凍干燥保藏法 液氨保藏法 低溫保藏法,六、菌種的擴大培養(yǎng),. 1） 表面培養(yǎng) 表面培養(yǎng)是將純種微生物接種在固體或液體培養(yǎng)基的表面的在恒溫條件 下進行靜置培養(yǎng)的方法。 2） 固體培養(yǎng) 固體培養(yǎng)法是將純種微生物接種在固體培養(yǎng)基上。,如實驗室中進行的固體斜面培養(yǎng)、固體平板培養(yǎng)都是表面培養(yǎng)；進行液體培養(yǎng)時，若細胞在液面生長繁殖，形成一層膜狀物，也為表面培養(yǎng)。表面培養(yǎng)的特點是生長在培養(yǎng)基表面上的微生物既能與空氣接觸吸收氧氣，又能與培養(yǎng)基接觸吸收營養(yǎng)。但是由于表面培養(yǎng)近于自然培養(yǎng)，因此存在生長緩慢，占用面積大，容易染菌等缺點，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中很少采用，僅在實驗室或小試中用得較多。,1、微生物的培養(yǎng)方法,工業(yè)上常用大米、麩皮、米糠、谷殼、木屑等為基本原料，適當補充一些其他營養(yǎng)成分和水分，經(jīng)滅菌后制成微生物培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基的特點是疏松，在培養(yǎng)基內(nèi)部充滿了空氣，因此既可以靜置培養(yǎng)，又可以通風培養(yǎng)。固體培養(yǎng)是介于表面培養(yǎng)和深層培養(yǎng)之間的一種培養(yǎng)方式，它的優(yōu)點是設(shè)備簡單，投資少，適合于小規(guī)模生產(chǎn)。缺點是占地面積大，勞動強度高，產(chǎn)品質(zhì)量不太穩(wěn)定。,. 3） 液體深層培養(yǎng) 液體深層培養(yǎng)又叫液體通風培養(yǎng)，菌體在液體培養(yǎng)基中處于懸浮狀態(tài)，導入培 養(yǎng)基中的空氣通過氣液界面?zhèn)髻|(zhì)進入液相，再擴散進入細胞內(nèi)部。液體深層培養(yǎng)是 在專門的發(fā)酵罐中進行的。,它的優(yōu)點是可以根據(jù)微生物在生長過程中對碳源、氮源、生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)及溫度、PH值、需氧量等條件的不同需要，合理配制，補加各種營養(yǎng)物質(zhì)和隨時調(diào)節(jié)溫度、PH值和通風量，這就有可能把微生物培養(yǎng)過程的生長、代謝都控制在最佳狀態(tài)而收到最好的培養(yǎng)效果。,2、微生物的擴大培養(yǎng),現(xiàn)代的發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模越來越大，每只發(fā)酵罐的容積有幾十立方米甚至幾百立方米，要使小小的微生物在幾十小時的較短時間內(nèi)，完成如此巨大的發(fā)酵轉(zhuǎn)化任務(wù)，那就必須具備數(shù)量巨大的微生物細胞才行。,菌種擴大培養(yǎng)的目的： 就是要為每次發(fā)酵罐的投料，提供相當數(shù)量的代謝旺盛的種子。,種子擴大培養(yǎng)的任務(wù)： 不但要得到純而壯的培養(yǎng)物，而且要獲得活力旺盛的、接種數(shù)量足夠的培養(yǎng)物。,種子擴大培養(yǎng)的過程： 斜面菌種 一級種子培養(yǎng) 二級種子培養(yǎng) 發(fā)酵罐,因為發(fā)酵時間的長短和接種量的大小有關(guān)，接種量大，發(fā)酵時間則短。將較多數(shù)量的成熟菌體接入發(fā)酵罐中，就有利于縮短發(fā)酵時間，提高發(fā)酵罐利用率，并且也有利于減少染菌的機會。,種子擴大培養(yǎng)流程圖P25圖2-2,實驗室種子制備階段 （一級種子培養(yǎng)）,生產(chǎn)車間種子制備階段 （二級種子培養(yǎng)、 三級種子培養(yǎng)） 二級發(fā)酵 三級發(fā)酵,砂土孢子,冷凍干燥孢子,斜面孢子,搖瓶液體培養(yǎng),茄子瓶斜面培養(yǎng),固體培養(yǎng)基培養(yǎng),一級種子罐,二級種子罐,發(fā)酵罐,種子罐級數(shù)是指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。對于生長快的細菌，種子用量少，故種子罐數(shù)相應(yīng)也少。如谷氨酸生產(chǎn)，種子接入種子罐后于32C培養(yǎng)7-10h，菌濃達到108-109個/ml，即可接入發(fā)酵罐作為種子，這稱為一級種子罐擴大培養(yǎng)，也稱二級發(fā)酵。生長較慢的菌種，如青霉素生產(chǎn)菌種，種子接入一級種子罐27C培養(yǎng)40h后，再需移入裝有新鮮培養(yǎng)基的第二級種子罐，于27C培養(yǎng)10-24h移至發(fā)酵罐作為種子，這稱為二級種子罐擴大培養(yǎng)，也稱三級發(fā)酵。一般50m3發(fā)酵罐都采用三級發(fā)酵。,種子罐的級數(shù)越多好還是越少好？,種子罐的級數(shù)越少，越有利于簡化工藝和控制，并可減少由于多次移種而帶來染菌 的機會。但也必須考慮盡量延長發(fā)酵罐最終代謝產(chǎn)物積累的時間，縮短由于種子發(fā)芽、 生長而占用的非生產(chǎn)時間，以提高發(fā)酵罐的生產(chǎn)率。,問題1,問題2,什么叫接種齡？以什么接種齡接種較好？,指種子罐中培養(yǎng)的菌絲體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。通常接種齡以 菌絲處于生命極為旺盛的對數(shù)生長期，且培養(yǎng)液中菌體尚未達到最高峰時較為合適。對于 年輕的種子接入發(fā)酵罐后往往會出現(xiàn)前期生長緩慢，整個發(fā)酵周期延長；過老的種子會引 起生產(chǎn)能力下降而菌絲過早自溶。,問題3,什么叫接種量？以什么接種量接種較好？,指移入的種子液體積和接種后培養(yǎng)液體積的比例。如大多數(shù)抗生素發(fā)酵的最適接種 量為7%-15%，由棒狀桿菌進行谷氨酸發(fā)酵的接種量只需用1%。采用較大的接種量可以 縮短發(fā)酵罐中菌絲繁殖到達高峰的時間，但是，如果接種量過多，往往使菌絲生長過 快，培養(yǎng)液粘度增加，造成溶解氧供應(yīng)不足而影響產(chǎn)物的合成。,七、菌種退化及其防治,1、菌種退化的結(jié)果,使微生物個體和群體特征的各個方面發(fā)生變化，其中最重要的是使所需產(chǎn)物的生產(chǎn)產(chǎn)量下降、營養(yǎng)物質(zhì)代謝和生長繁殖能力下降、發(fā)酵周期延長、抗不良環(huán)境條件性能減弱等。,菌種的退化不同于培養(yǎng)過程中由環(huán)境條件變化引起的表面的、暫時的變化，而是由個別、少數(shù)菌體細胞衰退后逐漸導致整個菌株退化的一個從量變到質(zhì)變的遺傳變異過程。,2、菌種退化的原因,菌種的退化是由于微生物細胞內(nèi)的DNA 結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而使由DNA決定的性狀發(fā)生相應(yīng)的變化。菌種的退化的原因可歸結(jié)為內(nèi)因和外因兩個方面，即自身變化和環(huán)境影響。,1）環(huán)境條件引起菌種退化,菌種連續(xù)傳代是菌種發(fā)生退化的直接原因。 使培養(yǎng)物常處于旺盛的生長狀態(tài)、且每次傳代時營養(yǎng)和環(huán)境條件都是在不斷的變化。,2）菌種自身突變引起菌種退化,菌種的自發(fā)突變和回復突變是引起菌種自身變化的主要原因。微生物細胞在每一世代中的突變機率一般為10-8-10-9，保藏在0-4度時這一突變機率更小，但仍然不能排除菌種退化的可能。,名詞,回復突變?,指變異菌株因遺傳組成的自身修復，使原有的遺傳障礙解除，代謝途徑發(fā)生變化，從而恢復原有的特性，表現(xiàn)出原育種過程中已獲得的優(yōu)良性狀的退化。 “返祖”,3、菌種退化的防治,由于菌種的退化將會引起發(fā)酵過程的產(chǎn)量急劇下降，一旦發(fā)生菌種退化，就必須采取有效的預防和防治措施，防止菌種的優(yōu)良性能發(fā)生退化，同時若發(fā)現(xiàn)某些優(yōu)良性狀退化，應(yīng)及時進行分離純化，使生產(chǎn)菌種保持穩(wěn)定的優(yōu)良特性。,1）退化菌種的復壯,名詞,菌種的復壯?,指已經(jīng)退化的菌種中（淘汰）衰退的個體，使其恢復原來優(yōu)良的特性。具體措施有：,A、配合一定的培養(yǎng)條件，對退化菌株進行單菌落或單細胞分離，淘汰退化的個體，純化菌種； B、將芽孢桿菌的懸液加熱至90處理數(shù)分鐘，殺滅已退化的菌體，保留芽孢；再將芽孢