相關(guān)背景資料

關(guān)于PET-28a載體的表達(dá)用PET-28a載體的原核表達(dá)出來的蛋白一般會(huì)是出現(xiàn)在上清呢，還是會(huì)出現(xiàn)沉淀中?。窟@個(gè)載體表達(dá)出來的一般是不是包涵體？ 用pet-28a載體的原核表達(dá)出來的蛋白在破菌前肯定會(huì)出現(xiàn)在菌體沉淀中，不會(huì)分泌在培養(yǎng)基上清中的。至于破菌以后，表達(dá)出來的在沉淀中還是在上清中，要由目標(biāo)蛋白的性質(zhì)來定了，沒有固定形式的。至于是否是包涵體，主要也是由目的蛋白的性質(zhì)與表達(dá)量來決定的，pet-28a這種載體沒有本身溶解性高的多肽融合蛋白，也沒有催化二硫鍵形成的酶融合蛋白，而且不含信號(hào)肽序列，所以同一種蛋白用這個(gè)載體，形成包涵體的可能性更大些。 樓主是的是大腸桿菌作為外源基因表達(dá)的宿主嗎？相對(duì)其他生物細(xì)胞而言，大腸桿菌的蛋白分泌機(jī)制并不健全。外源生物基因，特別是外源真核生物基因很難在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá)，少數(shù)的外源基因即便能分泌表達(dá)，其表達(dá)率通常也比包涵體方式低得多。蛋白產(chǎn)物N端信號(hào)肽序列是蛋白質(zhì)分泌的前提條件，如果樓主用pet-28a載體表達(dá)的外源基因的5端不帶有信號(hào)肽序列的話，將如eastrocket戰(zhàn)友所言，表達(dá)出來的蛋白在破菌前肯定會(huì)出現(xiàn)在菌體沉淀中，但異源蛋白在原核細(xì)胞中的定位可能會(huì)有兩種情況，可能是以可溶性存在或不可溶性（包涵體）存在于細(xì)胞質(zhì)中，這主要取決于的異源蛋白的性質(zhì)和表達(dá)量。概念pEGFP-N3載體為真核細(xì)胞表達(dá)載體。 pEGFP-N3載體特點(diǎn)從結(jié)構(gòu)上看，該質(zhì)粒具有很強(qiáng)的復(fù)制能力，可以滿足隨宿主細(xì)胞分裂時(shí)跟隨胞質(zhì)遺傳給新生的子細(xì)胞，這是保證目的基因穩(wěn)定表達(dá)的因素之一； 含有高效的功能強(qiáng)大的啟動(dòng)子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)； 具有多克隆位點(diǎn)，便于目的基因的插入； 該載體具有neo基因，可以采用G418來篩選已成功轉(zhuǎn)染了該載體的靶細(xì)胞。 這些特殊的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)目的基因在靶細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。 pEGFP-N3載體上攜帶有EGFP蛋白表達(dá)基因，如上圖質(zhì)粒圖譜所示。 GFP的相關(guān)知識(shí)綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因來源于Jellyfish Aequorea Victoria， 是Shimomura等于1962年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，由238個(gè)氨基酸組成，分子量約為27Kd。GFPGFP在包括熱、極端PH和化學(xué)變性劑等苛刻條件下都很穩(wěn)定，用甲醛固定后會(huì)持續(xù)發(fā)出熒光，但在還原環(huán)境下熒光會(huì)很快熄滅。 與以往常用的報(bào)告基因相比，GFP具有以下優(yōu)點(diǎn)： 在熒光顯微鏡下，用波長約490 nm的紫外線激發(fā)后，即可觀察到綠色熒光，直接、簡捷、便于檢測； 無需任何的作用底物或共作用物,檢測的靈敏度不受反應(yīng)效率的影響，保證了極高的檢出率； 蛋白本身性質(zhì)穩(wěn)定； 可在多種異源生物中表達(dá)且無細(xì)胞毒性； 其基因片段長度較小(約717 bp)，易于構(gòu)建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持熒光激發(fā)活性，為研究其他基因表達(dá)產(chǎn)物的分布提供了方便。 EGFP是一種優(yōu)化的突變型GFP，使其產(chǎn)生的熒光較普通GFP強(qiáng)35倍，大大增強(qiáng)了其報(bào)告基因的敏感度。EGFP與其他蛋白的融合表達(dá)已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影響其發(fā)光。 Not限制性內(nèi)切酶，由豚鼠耳炎諾卡氏菌產(chǎn)生。 識(shí)別位點(diǎn)是：GCGGCCGC 切割后的片段具有黏性 它屬于 限制性內(nèi)切酶類。 BamH限制性內(nèi)切酶，由淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生。 識(shí)別位點(diǎn)是：GGATCC 切割后的片段具有黏性 它屬于限制性內(nèi)切酶類。 報(bào)告基因報(bào)告基因 (reporter gene)是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，也就是說，是一個(gè)其表達(dá)產(chǎn)物非常容易被鑒定的基因。把它的編碼序列和基因表達(dá)調(diào)節(jié)序列相融合形成嵌合基因，或與其它目的基因相融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，從而利用它的表達(dá)產(chǎn)物來標(biāo)定目的基因的表達(dá)調(diào)控，篩選得到轉(zhuǎn)化體。重組質(zhì)?；竞喗橘|(zhì)粒具有穩(wěn)定可靠和操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。如果要克隆較小的DNA片段(10kb)且結(jié)構(gòu)簡單,質(zhì)粒要比其它任何載體都要好。在質(zhì)粒載體上進(jìn)行克隆,從原理上說是很簡單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的DNA片段, 然后體外使兩者相連接, 再用所得到重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌,即可完成。但在實(shí)際工作中, 如何區(qū)分插入有外源DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應(yīng)中外源DNA片段和載體DNA的濃度比例,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下,也可以進(jìn)一步采取一些特殊的克隆策略,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環(huán)化,還可以利用遺傳學(xué)手段如互補(bǔ)現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。 反應(yīng)策略帶有非互補(bǔ)突出端的片段外源DNA片段和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)策略有以下幾種： 1、帶有非互補(bǔ)突出端的片段 用兩種不同的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化可以產(chǎn)生帶有非互補(bǔ)的粘性末端,這也是最容易克隆的DNA片段，一般情況下,常用質(zhì)粒載體均帶有多個(gè)不同限制酶的識(shí)別序列組成的多克隆位點(diǎn)，因而幾乎總能找到與外源DNA片段末端匹配的限制酶切位點(diǎn)的載體，從而將外源片段定向地克隆到載體上。也可在PCR擴(kuò)增時(shí)，在DNA片段兩端人為加上不同酶切位點(diǎn)以便與載體相連。 帶有相同的粘性末端2、帶有相同的粘性末端 用相同的酶或同尾酶處理可得到這樣的末端。 由于質(zhì)粒載體也必須用同一種酶消化，亦得到同樣的兩個(gè)相同粘性末端，因此在連接反應(yīng)中外源片段和質(zhì)粒載體DNA均可能發(fā)生自身環(huán)化或幾個(gè)分子串連形成寡聚物, 而且正反兩種連接方向都可能有。所以，必須仔細(xì)調(diào)整連接反應(yīng)中兩種DNA的濃度, 以便使正確的連接產(chǎn)物的數(shù)量達(dá)到最高水平。還可將載體DNA的5磷酸基團(tuán)用堿性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化。帶5端磷酸的外源DNA片段可以有效地與去磷酸化的載體相連, 產(chǎn)生一個(gè)帶有兩個(gè)缺口的開環(huán)分子,在轉(zhuǎn)入E. coli受體菌后的擴(kuò)增過程中缺口可自動(dòng)修復(fù)。 帶有平末端3、帶有平末端 是由產(chǎn)生平末端的限制酶或核酸外切酶消化產(chǎn)生，或由DNA聚合酶補(bǔ)平所致。由于平端的連接效率比粘性末端要低得多，故在其連接反應(yīng)中，T4 DNA連接酶的濃度和外源DNA及載體DNA濃度均要高得多。通常還需加入低濃度的聚乙二醇(PEG 8000)以促進(jìn)DNA分子凝聚成聚集體的物質(zhì)以提高轉(zhuǎn)化效率。 特殊情況下外源DNA分子的末端與所用的載體末端無法相互匹配,則可以在線狀質(zhì)粒載體末端或外源DNA片段末端接上合適的接頭(linker)或銜接頭(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶的klenow大片段部分填平3凹端,使不相匹配的末端轉(zhuǎn)變?yōu)榛パa(bǔ)末端或轉(zhuǎn)為平末端后再進(jìn)行連接。IPTG 中文品名: 異丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷 商品名稱: Isopropyl -D-1-Thiogalactopyranoside 英文簡稱: IPTG 產(chǎn)品別名: Isopropyl -D-Thiogalactoside 通用CAS : 367-93-1 產(chǎn)品純度: Sigma 99%, Merck 98% ，INALCO99% 產(chǎn)品性狀: 白色或白色粉末,溶于水后呈清亮無色液體 分 子 式: C9H18O5S 分 子 量: 238.30 保存溫度: 2-8C冷藏保存 ,配制好后保存于-20C，室溫可放置一個(gè)月 主要作用：異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定,因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用 IPTG是半乳糖苷酶的活性誘導(dǎo)物質(zhì)?；谶@個(gè)特性，當(dāng)pUC系列的載體DNA（或其他帶有l(wèi)acZ 基因載體DNA）以lacZ 缺失細(xì)胞為宿主進(jìn)行轉(zhuǎn)化時(shí)、或用M13噬菌體的載體DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，如果在平板培養(yǎng)基中加入XGal和IPTG，由于半乳糖苷酶的互補(bǔ)性，可以根據(jù)是否呈現(xiàn)白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑選出基因重組體。此外，它還可以作為具有l(wèi)ac或tac等啟動(dòng)子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物使用。 誘導(dǎo)原理： E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié) 基因I（圖15-4）。I基因編碼一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子（元）受阻遏而處于關(guān)閉狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激 活蛋白（CAP）結(jié)合位點(diǎn)。由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成lac操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表 達(dá) 。在沒有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)。此時(shí)，I序列在PI啟動(dòng)序列操縱下表達(dá)的Lac阻遏蛋白與O序列結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié) 合，抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）即可被誘導(dǎo)。在這個(gè)操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)b半乳糖苷 酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?。后者作為一種誘導(dǎo)劑分子結(jié)合阻遏蛋白，使蛋白構(gòu)象變化，導(dǎo)致阻遏蛋白與O序列解離、發(fā)生轉(zhuǎn)錄。異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一 種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。 使用方法： 首先把IPTG配制成24 mg/ml（100 mM）的水溶液，并進(jìn)行過濾除菌后保存。然 后在100 ml的瓊脂培養(yǎng)基中，加入100 l的上述溶液、200 l的X-Gal（20 mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液）和100 l的Amp（100 mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培養(yǎng)基。 當(dāng)DNA片段插入至pUC系列載體（或其他帶有l(wèi)acZ、Amp基因載體），然后轉(zhuǎn)化至lacZ缺失細(xì)胞中后，涂布上述的IPTG、XGal、Amp平板培養(yǎng)基，可根據(jù)長出菌體的藍(lán)白色，而方便地挑選出基因重組體（白色為具有DNA插入片段的基因重組體）。 DH5菌株基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15 (lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, 特點(diǎn)：一種常用于質(zhì)?？寺〉木辍?其80dlacZM15基因的表達(dá)產(chǎn)物與pUC載體編碼的-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)，可用于藍(lán)白斑篩選。recA1和 endA1的突變有利于克隆DNA的穩(wěn)定和高純度質(zhì)粒DNA的提取。用途：分子克隆、質(zhì)粒提取和蛋白質(zhì)表達(dá)。表達(dá)載體科技名詞定義中文名稱：表達(dá)載體 英文名稱：expression vector 定義1：能使插入基因進(jìn)入宿主細(xì)胞表達(dá)的克隆載體，包括原核表達(dá)載體和真核表達(dá)載體，可以是質(zhì)粒、噬菌體或病毒等。典型的表達(dá)載體帶有能使基因表達(dá)的調(diào)控序列，并在適當(dāng)位置有可插入外源基因的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。 所屬學(xué)科：生物化學(xué)與分子生物學(xué)（一級(jí)學(xué)科）；方法與技術(shù)（二級(jí)學(xué)科） 定義2：攜帶外源DNA并使之在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體。 所屬學(xué)科：遺傳學(xué)（一級(jí)學(xué)科）；分子遺傳學(xué)（二級(jí)學(xué)科） 本內(nèi)容由全國科學(xué)技術(shù)名詞審定委員會(huì)審定公布 表達(dá)載體四部分：目的基因、啟動(dòng)子、終止子、標(biāo)記基因 常用細(xì)菌質(zhì)粒進(jìn)行構(gòu)建，構(gòu)建過程中運(yùn)用限制性核酸內(nèi)切酶切割出與目的基因相合的末端（多為黏性末端，也有平末端），采用DNA連接酶連接，導(dǎo)入生物體實(shí)現(xiàn)表達(dá)。標(biāo)記基因可幫助識(shí)別質(zhì)粒并檢測是否成功整合到染色體DNA中。 表達(dá)載體（Expression vectors）就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件（如啟動(dòng)子、RBS、終止子等），是目的基因能夠表達(dá)的載體。如表達(dá)載體pKK223-3是一個(gè)具有典型表達(dá)結(jié)構(gòu)的大腸桿菌表達(dá)載體。其基本骨架為來自pBR322和pUC的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因。在表達(dá)元件中，有一個(gè)雜合tac強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子，在啟動(dòng)子下游有RBS位點(diǎn)（如果利用這個(gè)位點(diǎn)，要求與ATG之間間隔5-13bp），其后的多克隆位點(diǎn)可裝載要表達(dá)的目標(biāo)基因。BL-21BL21是常用的表達(dá)菌株，一般配合以強(qiáng)表達(dá)載體來進(jìn)行目的基因的強(qiáng)表達(dá)。BL21（DE3）pLysS對(duì)DE3（1）是溶源性的。DE3含有T7噬菌體基因I，編碼的T7 RNA聚合酶受lac UV5啟動(dòng)子的控制。BL21（DE3）pLysS含有pLysS質(zhì)粒，他攜帶編碼T7溶菌酶基因。在T7啟動(dòng)子控制下，T7溶菌酶降低靶基因的背景表達(dá)但并不干擾由IPTG誘導(dǎo)的表達(dá)水平。 原核表達(dá)-宿主菌株選擇指南在原核蛋白表達(dá)過程中，選擇構(gòu)建一個(gè)合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件,以獲得最滿意的表達(dá)效果。事實(shí)上，在平時(shí)的實(shí)驗(yàn)中，最容易被忽視的就是宿主菌的選擇多數(shù)人會(huì)直接選擇自己實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用過的表達(dá)菌株，或者是載體配套的菌株，而不去追究原因即使表達(dá)結(jié)果不佳，大多在表達(dá)條件和載體上找原因，也不會(huì)考究菌株的選擇是否適合。作為原核表達(dá)的宿主，對(duì)外源基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一定的影響，是勿庸置疑的。每一個(gè)宿主細(xì)胞都像一個(gè)微觀的小工廠，按照細(xì)胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務(wù)”因?yàn)楹茈y親眼觀察微觀世界中表達(dá)是如何進(jìn)行的，當(dāng)出現(xiàn)問題時(shí)，我們需要經(jīng)驗(yàn)判斷問題所在。宿主細(xì)胞對(duì)原核表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生哪些影響呢？知其然還要知其所以然。比如，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。堪稱經(jīng)典的BL21 系列 就是lon 和ompT 蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候，真核基因中的一些密碼子對(duì)于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta 2 系列就是更好的選擇 這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的 BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG）稀有密碼子對(duì)應(yīng)的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。（已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒）當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時(shí)，可以選擇K-12衍生菌Origami 2系列，thioredoxin reductase (trxB)和glutathione reductase (gor)兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率，促進(jìn)蛋白可溶性及活性表達(dá)。（卡那霉素敏感）Rosetta-gami 2 則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點(diǎn)，既補(bǔ)充7種稀有密碼子，又能夠促進(jìn)二硫鍵的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真核蛋白。（卡那霉素敏感）Origami B 是衍生自 lacZY突變的 BL21菌株，這個(gè)突變能根據(jù)IPTG的濃度精確調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。（四環(huán)素敏感）在決定試用這些名字古怪的菌株時(shí)，有幾個(gè)小Tips要注意的，一個(gè)是不同菌株有時(shí)已經(jīng)攜帶某個(gè)質(zhì)?；蛘咭呀?jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是否能與之兼容。比如Rosetta 2 已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒，不能再用氯霉素篩選等等。table=98%trtd=1,1,115b現(xiàn)象/b /tdtd=1,1,120b可能原因/b /tdtd=1,1,200b改進(jìn)方案/b /tdtd=1,1,132b建議菌株/b /td/trtrtd=1,1,115無蛋白表達(dá)/tdtd=1,2,120E. coli 的密碼子偏移性/tdtd=1,2,200補(bǔ)充稀有密碼子的tRNA；將稀有密碼子突變?yōu)槠胀ù竽c桿菌密碼子/tdtd=1,2,132Rosetta 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami BRosettaBlue/td/trtrtd=1,1,115出現(xiàn)截短蛋白/td/trtrtd=1,2,115包涵體/tdtd=1,1,120二硫鍵形成困難/tdtd=1,1,200降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽/tdtd=1,1,132Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B/td/trtrtd=1,1,120表達(dá)過快，表達(dá)量過高/tdtd=1,1,200控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化/tdtd=1,1,132TunerRosetta-gami B/td/trtrtd=1,2,115蛋白無活性/tdtd=1,2,120蛋白錯(cuò)誤折疊/tdtd=1,1,200降低宿主胞質(zhì)的還原性；利用促進(jìn)二硫鍵形成的各種載體標(biāo)簽/tdtd=1,1,132Origami 2Rosetta-gami 2Rosetta-gami B/td/trtrtd=1,1,200控制優(yōu)化表達(dá)水平：降溫，IPTG濃度優(yōu)化/tdtd=1,1,132TunerRosetta-gami B/td/trtr=#f7fbfftd=1,1,115細(xì)胞死亡，生長極困難/tdtd=1,1,120毒性蛋白/tdtd=1,1,200更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制/tdtd=1,1,132pLysS 菌株/td/trtr=#f7fbfftd=1,1,115無克隆生長/tdtd=1,1,120過高本底表達(dá)/tdtd=1,1,200更嚴(yán)格的本底表達(dá)控制/tdtd=1,1,132pLysS、pLysE 菌株/td/tr/tableb重組質(zhì)粒和菌株的保存建議/b 在實(shí)驗(yàn)室里保存重組菌株的時(shí)候，為了挑菌和傳代方便，我們常用LB平板保存在4冰箱中，需要提質(zhì)粒和表達(dá)接種的時(shí)候，就直接從平板上挑菌，但是這種方法對(duì)于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性不利，容易出現(xiàn)質(zhì)粒丟失、表達(dá)水平不穩(wěn)定、菌株退化乃至發(fā)生污染等情況。我們建議：1、長期存放菌株和pET重組子應(yīng)該存在甘油70保種。但是要注意高濃度甘油( 10%)會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒不穩(wěn)定。請(qǐng)盡量保持甘油濃度8%。（15%濃度的甘油保種液和新鮮菌液1:1就行）2、重組質(zhì)粒不宜長期保存于表達(dá)菌株（帶DE3的大腸桿菌）中，請(qǐng)盡量使用帶有recA endA突變的克隆菌株（比如C600，DH5a）進(jìn)行質(zhì)粒抽提和保存質(zhì)粒。表達(dá)型的菌株提質(zhì)粒經(jīng)常會(huì)有質(zhì)量不高或者背景的問題。特別是大量抽提。其實(shí)不僅僅是表達(dá)，建庫克隆都會(huì)涉及菌株的不同要求，推薦看看以下文章：克隆/建庫專用超級(jí)高效感受態(tài)細(xì)胞 。感受態(tài)不是目的，菌株的背景才是關(guān)鍵。在原核蛋白表達(dá)過程中，選擇構(gòu)建一個(gè)合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮3大因素：表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件,以獲得最滿意的表達(dá)效果。事實(shí)上，在平時(shí)的實(shí)驗(yàn)中，最容易被忽視的就是宿主菌的選擇多數(shù)人會(huì)直接選擇自己實(shí)驗(yàn)室曾經(jīng)用過的表達(dá)菌株，或者是載體配套的菌株，而不去追究原因即使表達(dá)結(jié)果不佳，大多在表達(dá)條件和載體上找原因，也不會(huì)考究菌株的選擇是否適合。作為原核表達(dá)的宿主，對(duì)外源基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一定的影響，是勿庸置疑的。每一個(gè)宿主細(xì)胞都像一個(gè)微觀的小工廠，按照細(xì)胞固有的程序完成“你給它們安排的生產(chǎn)任務(wù)”因?yàn)楹茈y親眼觀察微觀世界中表達(dá)是如何進(jìn)行的，當(dāng)出現(xiàn)問題時(shí)，我們需要經(jīng)驗(yàn)判斷問題所在。宿主細(xì)胞對(duì)原核表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生哪些影響呢？知其然還要知其所以然。比如，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會(huì)造成外源表達(dá)產(chǎn)物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。堪稱經(jīng)典的BL21 系列 就是lon 和ompT 蛋白酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。大名鼎鼎的BL21(DE3)融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計(jì)。真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的時(shí)候，真核基因中的一些密碼子對(duì)于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta 2 系列就是更好的選擇 這種攜帶pRARE2質(zhì)粒的 BL21衍生菌，補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的七種（AUA,AGG,AGA,CUA,CCC,GGA 及CGG）稀有密碼子對(duì)應(yīng)的 tRNA，