多聚甲醛配制

4多聚甲醛配制4多聚甲醛配制方法1) 900 ml dd H20 + 500 ul 1N NaOH2) Heat to 65-703) While stirring, add 40 g paraformaldehyde4) Continue heating and stirring until paraformaldehyde is dissolved5) Let cool to room temperature6) Add 100 ml of 10X PBS7) pH to 7.3 with HCl8) Sterile with filter9) Store at 4, protected from light稱(chēng)量2g，放置與50ml pbs中，37度孵箱2天后，4%的多聚甲醛就配好了。配制0.1M的PBS，PH=7.2-7.4,100mlPBS+4g多聚甲醛，放入65水浴，一般半天左右就可以溶好因?yàn)樾枰F(xiàn)用現(xiàn)配所以我一般就配10毫升。用一個(gè)帶蓋的玻璃離心管加0.4克多聚甲醛，加8毫升PBS，加1毫升2N的NAOH，放到60度的水浴里，10分鐘，拿出來(lái)用手顛倒幾次，基本上就都溶了，再用HCL調(diào)ph到7.2，最后定容就行了，我最快10分鐘搞定。取4g 多聚甲醛溶到100 PBS緩沖液，加2滴1N的NaOH（pH7.4）,60度水浴磁力攪拌，大約1-2小時(shí)可以溶解。4%多聚甲醛的配制:在放置磁力攪拌棒的容器中,將4克多聚甲醛(EM級(jí))溶解于100ml PBS,加入數(shù)滴NaOH,在通風(fēng)廚中60加熱(打開(kāi)瓶蓋)使溶解,冷卻至室溫,調(diào)整PH值為7.4,使用前新鮮配制.常用的固定劑種類(lèi)很多,固定劑的正確選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性.固定劑可分為兩類(lèi):有機(jī)溶劑和交聯(lián)劑.有機(jī)溶劑如乙醇和丙酮能夠去處脂類(lèi)物質(zhì)使細(xì)胞脫水,把蛋白質(zhì)沉淀在細(xì)胞結(jié)構(gòu)上.交聯(lián)劑如多聚甲醛一般通過(guò)自由氨基基團(tuán)把生物分子橋連起來(lái),形成一個(gè)相互交聯(lián)的抗原網(wǎng).許多人發(fā)現(xiàn)用交聯(lián)劑固定細(xì)胞效果較好,尤其是做免疫熒光的時(shí)候,當(dāng)然沒(méi)有固定的規(guī)則可言.不過(guò),單獨(dú)用多聚甲醛固定的細(xì)胞不能使抗體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),因此,標(biāo)本固定后必須用非離子去污劑(triton-x 100)透化標(biāo)本.4多聚甲醛（PFA）配制稱(chēng)取40gPFA溶于裝有500mlDEPC水的玻璃容器（燒杯或燒瓶）中，持續(xù)加熱磁力攪拌至6065,使成乳白色懸液。用1.0mmol/L 的NaOH調(diào)PH至7.0使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml 2PBS，充分混勻（在冰浴或冷水浴中）?？稍贆z測(cè)一下PH，過(guò)濾后定容至1000ml，室溫或4（保存?zhèn)溆茫?。注意?.配制時(shí)應(yīng)在通風(fēng)條件下操作，并避免接觸皮膚及吸入（戴口罩及手套），因PFA有較強(qiáng)的毒性，對(duì)粘膜及皮膚有刺激作用。2.加熱時(shí)，溫度不可過(guò)高，常為6065。否則PFA降解失效，配制好的PFA雖可有效一點(diǎn)時(shí)間，但過(guò)久的液體，固定效果下降，應(yīng)用前新鮮配制。4%多聚甲醛固定液配制多聚甲醛(PFA) 40g ,雙蒸水500ml在60-65度加熱成乳白色懸液（用1.0mol/LNaOH調(diào)制7.0或7.2-7.4 ）用0.1molPBS定容至1000ml。除了用DEPC水配制PFA外，也可以用滅菌蒸餾水或經(jīng)DEPC處理的0.010.1/L的PBS配制，方法及主要事項(xiàng)同上。制備的單細(xì)胞懸液用70%乙醇固定，4過(guò)夜。次日生理鹽水洗脫液洗滌去除固定液。加PI染液混勻，至4避光30min，上機(jī)測(cè)試。正常對(duì)照細(xì)胞呈紅色熒光，凋亡細(xì)胞呈藍(lán)色熒光，在流式細(xì)胞儀DNA直方圖上，由于凋亡細(xì)胞的出現(xiàn)，二倍