蛋白質(zhì)的Wesrern印跡分析.ppt

蛋白質(zhì)的Western印跡分析,劉二戰(zhàn),一、原理,一個(gè)基因表達(dá)的最終產(chǎn)物是產(chǎn)生相應(yīng)的蛋白，因此檢測(cè)蛋白是測(cè)定基因表達(dá)的主要標(biāo)志。 原理：Western Blotting 是將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過(guò)SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳，對(duì)不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離；并通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物上，用抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體（一抗）與轉(zhuǎn)印后膜進(jìn)行雜交，使其與膜上的靶蛋白特異性結(jié)合；再與經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，最后用ECL試劑反應(yīng)，經(jīng)X線片曝光、顯影等一系列反應(yīng)，檢測(cè)蛋白質(zhì)等生物大分子。,二、方法,樣品蛋白的制備,SDS-聚丙稀酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜,檢測(cè),三、樣品蛋白的制備,1、原理： 蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識(shí)，但基本原理只有兩個(gè)方面： 一是用混合物中幾個(gè)組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個(gè)或幾個(gè)物相中，如鹽析、有機(jī)溶劑提取、層析和結(jié)晶等； 二是將混合物置于單一物相中，通過(guò)物理力場(chǎng)的作用使備組分分配于不同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳、超速離心、超濾等。,三、樣品蛋白的制備,2、蛋白質(zhì)制備的步驟 （1） 選擇材料和預(yù)處理 （2）細(xì)胞的破碎及細(xì)胞的分離 （3）提取和純化 （4）濃縮、干燥和保存,三、 樣品蛋白的制備,3、培養(yǎng)細(xì)胞中蛋白質(zhì)樣品的提取,提取細(xì)胞蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理，在提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中要考慮到細(xì)胞裂解液的pH、去污劑的類型和濃度，以及二價(jià)陽(yáng)離子、輔助因子等因素，同時(shí)為防止細(xì)胞內(nèi)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解，需在裂解液中加入蛋白酶抑制劑。,三、樣品蛋白的制備,3.1 實(shí)驗(yàn)材料,（1）器材： 冷凍離心機(jī)， 細(xì)胞刮，Tip頭、1.5ml、 0.5ml 滅菌Ep管，碎冰。 （2）試劑： 細(xì)胞總蛋白裂解液（100ml）: 1PBS 80ml，Triton-100 1ml, 去氧膽酸鈉0.5g, SDS 0.1g, 補(bǔ) 1PBS緩沖液至100ml。 PMSF貯存液（PMSF 17.4mg/異丙醇）： PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不穩(wěn)定，應(yīng)在臨用前向不含PMSF的裂解緩沖液中加入PMSF貯存液100ul,使其終濃度為0.174mg/ml。 （3）Hela 細(xì)胞,三、 樣品蛋白的制備,3.2 實(shí)驗(yàn)方法,（1） 洗滌細(xì)胞：選取細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的Hela細(xì)胞，由37取出后放入冰盤中，預(yù)冷。吸棄原培養(yǎng)液，用4 預(yù)冷的1PBS洗細(xì)胞表面34次，除凈培養(yǎng)基中的血清，并盡量吸棄細(xì)胞培養(yǎng)皿中殘余的PBS。 （2） 向培養(yǎng)皿中加入蛋白裂解液(100ul/60mm)，輕輕晃動(dòng)，使裂解液均勻鋪于細(xì)胞表面。 （3） 冰浴3060min，期間晃動(dòng)34次。 （4） 用細(xì)胞刮子集中裂解液，收集入冰上預(yù)冷的1.5ml Ep 管中， 4 離心，12000g 20min. （5） 小心吸取上清液入新的預(yù)冷管中（為避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白降解，可按需要將其分裝使用），-80 保有存?zhèn)溆茫杀４?年）,三、 樣品蛋白的制備,3.3 注意事項(xiàng),（1） 注意個(gè)人防護(hù)：PMSF嚴(yán)重?fù)p害呼吸道黏膜、眼睛及皮膚，吸入、吞進(jìn)或通過(guò)皮膚吸收有致命危險(xiǎn)。一旦眼晴或皮膚接觸了PMSF，立即用大量清水沖洗。 （2） 設(shè)立必要實(shí)驗(yàn)對(duì)照。 （3） 為防止蛋白降解，上述操作全部應(yīng)在冰上完成。 （4） 所用離心機(jī)需要提前預(yù)冷。 （5）可于顯微鏡下觀察細(xì)胸裂解的程度。 （6）吸取蛋白上清液時(shí)，注意不要把沉淀吸上來(lái)。,三、 樣品蛋白的制備,4、蛋白質(zhì)的濃度測(cè)定考馬斯亮藍(lán)蛋白定量法 考馬斯亮藍(lán) G250 法是比色法與色素法相結(jié)合的復(fù)合方法，簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，穩(wěn)定性好，是一種較好的常用方法。 4.1 原理 考馬斯亮藍(lán) G-250 在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在 488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在 595nm 波長(zhǎng)下有最大光吸收。 其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比， 因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。 蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán) G-250 結(jié)合在 2min 左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下 1h 內(nèi)保持穩(wěn)定。,三、 樣品蛋白的制備,4.2 實(shí)驗(yàn)材料 （1）器材：分光光度計(jì)及玻璃比色皿 （2）試劑： 0.5% mg/ml BSA 標(biāo)準(zhǔn)蛋白液：生理鹽水配制，分裝小管，4保存。 考馬斯亮藍(lán) G-250 母液：稱取考馬斯亮藍(lán) G-250 100mg 溶于 50 ml 95%乙醇，加入 100 ml 濃磷酸(W/V)。過(guò)濾， 4保存6個(gè)月。 考馬斯亮藍(lán) G-250 使用液（0.01%考馬斯亮藍(lán) G-250 ）：取考馬斯亮藍(lán)G-250 母液 15 ml，加蒸餾水稀釋至 85 ml，臨用前稀釋。,三、 樣品蛋白的制備,4.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1） 稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品及制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：用生理鹽水將 0.5mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)蛋白液稀釋成 0,1,2,4,8,10,12 ug/100ul （2）上述每管中分別加入 1.5ml 考馬斯亮藍(lán) G-250 使用液，室溫反應(yīng)后測(cè)定 595 nm吸光度值(OD595)，依據(jù)所得數(shù)據(jù)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 （3）稀釋待測(cè)蛋白樣品：吸取細(xì)胞總蛋白樣品 2 ul，加入 98 ul 水（總體積為 100 ul ）和 1.5 ml 考馬斯亮藍(lán)使用液，混勻后室溫反應(yīng)35 min，測(cè)定OD595 。 （4）計(jì)算樣品總蛋白含量(ug/ul)：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，找出樣品蛋白在圖中的位置，并計(jì)算出蛋白含量。,三、 樣品蛋白的制備,4.4 注意事項(xiàng) （1）制作的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線如不規(guī)律，應(yīng)重新再做。 （2）如果待測(cè)樣品濃度高（如組織提取物），可用生理鹽水稀釋倍后測(cè)定；如樣品濃度底，可適當(dāng)增加樣品體積及減少水的體積。 （3）比色皿的清潔：由于測(cè)定液中含有考馬斯亮藍(lán)，使用過(guò)的比色皿呈藍(lán)色并藍(lán)色不易被清水沖洗掉，需用無(wú)水乙醇先將比色皿脫色皿脫色數(shù)分鐘，而后分別用自來(lái)水、蒸餾水沖洗干凈。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,1、原理,各種蛋白質(zhì)因所帶的凈電荷、分子量大小和形狀不同面有不同的遷移率。如果在電泳體系加入SDS，形成帶負(fù)電荷長(zhǎng)橢圓棒狀的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物。從而消除蛋白質(zhì)原有的電荷和形體差異，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。 當(dāng)對(duì)蛋白質(zhì)樣品做SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈分析時(shí)，要在樣品中加入含有SDS和B-巰基乙醇的樣品處理液。 樣品處理液中加入溴酚藍(lán)染料，用于控制電泳的過(guò)程。 另外在樣品液中加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)，使樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,SDS-聚丙烯酰胺凝膠的有效分離范圍取決于用于灌膠的聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠大多按雙丙烯酰胺：丙烯酰胺為了1：29配制，實(shí)驗(yàn)表明它能分離大小相差只有3%的多肽。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈成功的關(guān)鍵之一是電泳過(guò)程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。影響它們結(jié)合的因素主要有三個(gè)： （1） 溶液中SDS單體的濃度 SDS在水溶液中是以單體和SDS-多肽膠束的混合形式存，能與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的是單體。單體的濃度與SDS總濃度、溫度和離子強(qiáng)度有關(guān)。 （2） 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度 SDS-PAGE的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，常為10100mmol/L (3) 二硫鍵是否完全被還原 只有二硫鍵被徹底還原后，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上，使蛋白質(zhì)的相對(duì)遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,2、實(shí)驗(yàn),2.1 實(shí)驗(yàn)材料 （1） 器材： 垂直電泳槽，穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀/電轉(zhuǎn)儀，蛋白變性用加熱儀器，Tip頭，Ep管，碎冰，注射器等。 （2）1.0mol/L TipHCl (PH 6.8)。 (3) 1.5mol/L TipHCl (PH 8.8)。 (4) 10%SDS室溫保存：去離子水配制。 （5）10%過(guò)硫酸銨（保存）：提供驅(qū)動(dòng)丙酰胺和雙丙烯酰胺聚合所必需的自由基。由于過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,（6）TEMED（N，N，N，N-四甲基乙二胺）：催化過(guò)硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的聚合。 （7）5 Tris-甘氨酸電泳緩沖液（1000ml）：去離子水500ml，Tris 堿15.1g，甘氨酸94g, 10%(W/V)電泳級(jí)SDS 50ml，補(bǔ)去離子水至1000ml。使用前做5稀釋 （8）4蛋白質(zhì)電泳上樣緩沖液 （9）蛋白質(zhì)預(yù)染Marker,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,2.1 實(shí)驗(yàn)方法,1、制備SDS-PAGE凝膠 （1）準(zhǔn)備SDS-PAGE凝膠電泳用玻璃板夾板 （2）配制10% SDS-PAGE分離膠（15ml） (3) 灌制分離膠 （4）立即用0.1%SDS液覆蓋膠面（隔絕空氣有助于凝膠聚合，使凝膠面形成平直），室溫放置約40min至分離膠凝固。 （5）配制5%濃縮膠4ml (可以與配制分離膠時(shí)同時(shí)進(jìn)行),四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,（6） 倒掉（吸附）0.1%SDS覆蓋液，用去離子水沖洗分離膠表面34次，以洗凈未聚合的丙烯酰胺（避免在膠頂部或玻璃夾板中留有氣泡），并用吸水紙吸掉殘留的液體。 （7） 將凝膠板重新垂直放置，輕輕加入5%積層膠液（注意避免產(chǎn)生汽泡），插入樣品梳，使液面至樣品梳上標(biāo)志位置，室溫凝膠約40min. (8) 輕輕拔去梳子，撕去封玻璃夾板用透明帶，將玻璃夾板“凹”面緊貼緊電泳槽，兩側(cè)用夾子很好地固定在電泳槽上。用針頭式注射注射器吸取電泳緩沖液輕輕沖洗點(diǎn)樣孔，以去除未聚合的凝膠，待上電泳。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,2、樣品變性及電泳 （1）由 -80冰箱取出Hela細(xì)胞總蛋白樣品，立即插入冰中（減少蛋白降解）待其融化。 （2）吸取細(xì)胞總蛋白樣品15 ul 加入0.5 ul EP管中，每樣品管中分別加入5ul 4蛋白質(zhì)凝膠電泳上樣緩沖液，輕輕混合，98變性8min（同時(shí)變性標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker），立即插入冰中，渦旋數(shù)秒，短暫離心。 （3）吸出變性蛋白液，貼緊加樣孔上方，將樣品輕輕加入凝膠孔中。 （4）將電泳儀設(shè)置成穩(wěn)壓狀態(tài)，接通電源，將電壓調(diào)至100V使樣品通過(guò)濃縮膠（電壓約8V/cm）。當(dāng)染料進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)高到130V（約15V/cm）,繼續(xù)電泳使染料至分離膠適當(dāng)位置（4冰箱中進(jìn)行電泳），結(jié)束電泳。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,注意事項(xiàng)： （1）設(shè)立必要的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)志物。 （2）丙烯酰胺和雙丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并容易吸附于皮膚，其作用具有累積性，故稱量時(shí)應(yīng)帶手套及口罩。 （3）不同廠家的SDS可引起多肽的遷移圖譜變化較大，建議認(rèn)準(zhǔn)使用某一試劑級(jí)別。 （4）一旦加入TEMED，應(yīng)立即混旋并快速灌注入玻璃夾板。 （5）過(guò)硫酸銨會(huì)緩慢分解，應(yīng)隔周新鮮配制。 （6）為保持電泳的平衡，在無(wú)樣品孔中也應(yīng)加入適量的4蛋白質(zhì)電泳液。,四、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電脈,（7）正確連接電泳連線正、負(fù)極方向（負(fù)極在上，正極在下），經(jīng)保證電荷由負(fù)極向正極流動(dòng)。 （8）凝膠玻璃板要定期做硅化處理：用氯仿或庚烷配成5%二氯二甲硅烷溶液，用其浸泡或擦拭玻璃板，有機(jī)溶劑揮發(fā)時(shí)，二氯二甲硅烷即沉積在玻璃制品上。使用前用水反復(fù)沖洗多次或于180烘烤2h。,五、轉(zhuǎn)膜,凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，然后分別用非標(biāo)記一抗及二級(jí)免疫試劑對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。 用于印跡法的固相支持物有多種，硝酸纖維素膜、尼龍膜及PVDF膜較為常用。下面是介紹PVDF（聚偏氟乙烯）膜作為固相支持物。 轉(zhuǎn)膜的方式有濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)，下面介紹的濕轉(zhuǎn)方法。,五、轉(zhuǎn)膜,1、實(shí)驗(yàn)材料 （1）器材： 轉(zhuǎn)移電泳儀，轉(zhuǎn)儀電泳槽，PVDF膜，剪刀，濾紙等。 （2）試劑： 轉(zhuǎn)移緩沖液：Tris 3.03 g，甘氨酸 14.4 g，甲醇 200 ml，補(bǔ)ddH2O至 1000ml，每次配完可用23次。最好現(xiàn)配現(xiàn)用。4 避光保存。 考馬斯亮藍(lán)染色液（100ml）：考馬斯亮藍(lán) R-250 0.25 g，甲醇 50ml ，乙酸 10ml，蒸留水 40ml。待考馬斯亮藍(lán)R-250溶解，用Whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾，以去除顆粒狀物質(zhì)。 脫色液：乙酸 10% (V/V)，甲醇 50% (V/V)，H2O 40% 。,五、轉(zhuǎn)膜,2、實(shí)驗(yàn)方法 （1）PDVF 膜及濾紙的預(yù)處理：剪裁與膠大小一致的PVDF膜，將其浸入甲醇液中浸泡10 s（快速激活PDVF 膜），去離子水處理5min，1轉(zhuǎn)移緩沖液處理10min以上。 （2）剪裁與膠同樣大小的6層濾紙，用轉(zhuǎn)移液緩沖液浸泡后待用。 （3）取下電泳板，將其平置（使凹面玻璃板在下），小心取出夾板中的墊片及去掉上層玻璃板，切除多余凝膠，將含樣品膠在蒸餾水及1轉(zhuǎn)膜液中各漂洗一次。,五、轉(zhuǎn)膜,（4）轉(zhuǎn)膜： 將樣品膠與膜裝入標(biāo)有正、負(fù)極的轉(zhuǎn)膜夾板中：由正極側(cè)開(kāi)始，依次為海綿墊片3層濾紙PVDF膜樣品膠三層濾紙（排除氣泡）海棉墊片，扣緊轉(zhuǎn)膜夾板，放入含有轉(zhuǎn)膜緩沖液的轉(zhuǎn)移電泳槽中。 正確連接轉(zhuǎn)移電泳連線，使電荷由負(fù)極向正極流動(dòng)。接通電源，恒壓狀態(tài)下，80V 轉(zhuǎn)膜2 h（此操作在4冰箱中進(jìn)行） 小心取出轉(zhuǎn)移膜（用鉛筆輕輕描出蛋白Marker帶），在1TBST液中漂洗兩次。 將凝膠浸入考馬斯亮藍(lán)染色液中，檢查蛋白轉(zhuǎn)移是否完全。,五、轉(zhuǎn)膜,注意事項(xiàng)： （1）開(kāi)始轉(zhuǎn)移時(shí)一定要檢查電流大小。過(guò)高電流產(chǎn)生的熱量會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)移失敗，通常高電流是由于轉(zhuǎn)移液配制不當(dāng)造成的。 （2）低離子強(qiáng)度轉(zhuǎn)移緩沖液可使用較高電壓，而不會(huì)導(dǎo)致高電流和過(guò)熱，但轉(zhuǎn)移過(guò)程中由凝膠中滲出的電解質(zhì)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移緩沖液電導(dǎo)增加，緩沖能力降低。 （3）也可在恒流狀態(tài)下以200mA轉(zhuǎn)移2h。 （4）若轉(zhuǎn)移中因凝膠變形發(fā)生條帶扭曲或由于凝膠中電解質(zhì)滲出導(dǎo)致過(guò)熱，可預(yù)先將凝膠在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡。,五、轉(zhuǎn)膜,（5）使用預(yù)先染色的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品或轉(zhuǎn)移后將凝膠染色，可檢查轉(zhuǎn)移是否徹底。 （6）對(duì)于較大蛋白質(zhì)，較低的丙烯酰胺濃度可獲得較好的轉(zhuǎn)移效果。 （7）對(duì)電轉(zhuǎn)移來(lái)說(shuō)，最常遇到的問(wèn)題是目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率低，轉(zhuǎn)移效率可由轉(zhuǎn)移后對(duì)凝膠或膜染色來(lái)進(jìn)行觀察。,六、檢測(cè),1、實(shí)驗(yàn)器材 （1）器材：搖床，避光盒，洗膜用平皿，X線片，X線片曝光盒等。 （2）試劑： 10TBST緩沖液：100 mmol/L TrisHCl (pH 8.0)，1500mmol/L NaCl，0.2% Tween-20，補(bǔ)水至1000ml，高壓滅菌，4保存，使用前稀釋10倍。 5%脫脂奶粉（1TBST配制）。 一抗：羊抗Actin (使用前用1TBST稀釋200倍)。 二抗：兔抗羊Ig G/HRP (使用前用1TBST稀釋2000倍)。 ECL試劑盒。,六、檢測(cè),2、實(shí)驗(yàn)方法 （1）封閉：將轉(zhuǎn)移后的膜放入5%（W/V）脫脂奶粉中，室溫、搖床上緩慢搖動(dòng)狀態(tài)下封閉1h(或4過(guò)夜)