《腸道細(xì)菌實(shí)驗(yàn)》PPT課件.ppt

第四次實(shí)驗(yàn)課內(nèi)容 1、細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢查（示教） 2、腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況 （示教） SS平板、雙糖鐵培養(yǎng)基 3、肥達(dá)試驗(yàn)（結(jié)果示教）,實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢查,細(xì)菌具有不同的代謝酶系統(tǒng)，因此對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用與分解能力也各不相同，可形成不同的中間代謝產(chǎn)物與終末代謝產(chǎn)物。根據(jù)細(xì)菌的代謝能力及其產(chǎn)物不同鑒別細(xì)菌，稱(chēng)為細(xì)菌的生化反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)介紹常用生化反應(yīng)的經(jīng)典試驗(yàn)方法，以了解細(xì)菌生化反應(yīng)的機(jī)制與實(shí)驗(yàn)原理。,原理：,染色鏡檢 普通瓊脂平板中菌落的形態(tài),不能鑒別,能夠鑒別,實(shí)驗(yàn)一 細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢查,細(xì)菌代謝產(chǎn)物,分解代謝產(chǎn)物,合成代謝產(chǎn)物,生化反應(yīng),?,細(xì)菌菌落的色素觀察,金黃色葡萄球菌：產(chǎn)生只局限于菌落的脂溶性金黃色色素。 銅綠假單胞菌：產(chǎn)生帶熒光的水溶性色素，該色素可擴(kuò)散至菌落周?chē)?，使培養(yǎng)基呈亮綠色。,金黃色葡萄球菌,銅綠假單胞菌,細(xì)菌菌落的溶血現(xiàn)象觀察,乙型溶血性鏈球菌:透明的無(wú)色溶血環(huán)。,一、糖發(fā)酵試驗(yàn),1.了解糖發(fā)酵的原理和在腸道細(xì)菌鑒定中的重要作用。 2.掌握通過(guò)糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。,基本原理,糖發(fā)酵試驗(yàn)是最常用的生化反應(yīng)，在腸道細(xì)菌的鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細(xì)菌都能利用糖類(lèi)作為碳源和能源，但是它們?cè)诜纸馓堑哪芰ι嫌泻艽蟮牟町?，有些?xì)菌能分解某種糖并產(chǎn)酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和氣體（如氫、甲烷、二氧化碳等）；有些細(xì)菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣；痢疾桿菌能分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能分解乳糖；乙型副傷寒桿菌分解葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不能分解乳糖。,基本原理,酸的產(chǎn)生可利用指示劑來(lái)斷定。在配制培養(yǎng)基時(shí)預(yù)先加入溴甲酚紫Ph5.2（黃色）-6.8（紫色），當(dāng)發(fā)酵產(chǎn)酸時(shí)，可使培養(yǎng)基由紫色變?yōu)辄S色。 氣體的產(chǎn)生可由發(fā)酵管中倒置的德漢氏小管中有無(wú)氣泡來(lái)證明。,糖發(fā)酵試驗(yàn)：,葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)：,四、操作步驟,1、編號(hào) 用記號(hào)筆在各試管上分別標(biāo)明發(fā)酵培養(yǎng)基名稱(chēng)和所接種的菌名。 2、接種 取盛有葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基的試管3支，分別接種大腸桿菌、痢疾桿菌、乙型副傷寒桿菌。另取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管3支，分別接種這三種細(xì)菌。 3將上述已接種的葡萄糖和乳糖發(fā)酵試管和對(duì)照管置37溫室中培養(yǎng)24小時(shí)。,圖1 糖類(lèi)發(fā)酵試驗(yàn),觀察結(jié)果:,觀察結(jié)果時(shí)，看各管顏色變化及杜氏小管有無(wú)氣泡。 產(chǎn)酸產(chǎn)氣用“”表示； 只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣用“+”表示； 不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣用“”表示。,二、靛基質(zhì)（吲哚）產(chǎn)生試驗(yàn)(I) 原理： 分解蛋白胨內(nèi)的色氨酸形成靛基質(zhì)（無(wú)色） 靛基質(zhì)與靛基質(zhì)試劑中的對(duì)二甲基氨基苯甲 醛結(jié)合而顯紅色(玫瑰吲哚) 材料：蛋白胨水培養(yǎng)基（氯化鈉、蛋白胨、 蒸餾水）,方法： 約0.3ml的靛基質(zhì)試劑徐徐加入細(xì)菌蛋白胨水培養(yǎng)物 注：加入吲哚試劑后切勿搖晃 結(jié)果：大腸桿菌()紅色 痢疾桿菌 ()黃色 乙型副傷寒桿菌 ()黃色,紅色吲哚,大腸桿菌,產(chǎn)氣桿菌,分 解,六、硫化氫產(chǎn)生試驗(yàn) 原理： 材料： 醋酸鉛培養(yǎng)基（普通瓊脂培養(yǎng)基、硫代硫酸鈉溶液、醋酸鉛溶液）,含硫氨基酸,硫化氫,遇鉛鹽或亞鐵鹽,黑褐色沉淀,方法： 結(jié)果： 乙型副傷寒，黑褐色 大腸埃希菌，不變色 ,乙型副傷寒,大腸桿菌,（21）半固體培養(yǎng)基(動(dòng)力試驗(yàn)),大腸埃希菌 志賀菌 傷寒沙門(mén)菌,材料： 1、 EMB培養(yǎng)基、SS瓊脂平板、雙糖鐵培養(yǎng)基 2、大腸埃希菌、傷寒沙門(mén)菌、志賀菌,選擇培養(yǎng)基,腸道桿菌在選擇鑒別培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況,鑒別培養(yǎng)基,SS培養(yǎng)基 （Salmonella Shigella Agar Medium）,原理：（ SS平板） 非致病菌：,致病菌：,不分解乳糖，菌落呈透明無(wú)色； 枸櫞酸鐵能指示硫化氫的產(chǎn)生，使菌落中心呈黑色,注意： 非致病菌并非被殺滅，故挑病原菌菌落時(shí)，盡量挑取菌落中心部分,大腸埃希菌,痢疾志賀菌,大腸埃希菌與傷寒沙門(mén)菌,雙糖鐵培養(yǎng)基 （Double sugar Iron Medium） 成分 含酚紅指示劑的pH7.6的蛋白胨水 500mL 瓊脂(1.3%) 6.5g 乳糖(1%) 5g 葡萄糖(0.1%) 0.5g 硫酸亞鐵銨(0.02%) 0.1g 硫代硫酸鈉(0.02%) 0.1g 用途 初步鑒別腸道桿菌,原理： 只分解葡萄糖 ： 產(chǎn)少量酸 上層培養(yǎng)基的酸+O2CO2 +H2O 蛋白胨代謝產(chǎn)物 下層培養(yǎng)基不接觸空氣培養(yǎng)基呈酸性顯黃色 葡萄糖、乳糖都分解 硫酸亞鐵銨： 用以檢查細(xì)菌分解蛋白質(zhì)后是否產(chǎn)生硫化氫。,只產(chǎn)酸 產(chǎn)酸&產(chǎn)氣,培養(yǎng)基略變堿,指示劑變紅,腸道桿菌的生長(zhǎng)結(jié)果,SS 雙糖鐵 大腸埃希菌 粉紅色大菌落 黃色 痢疾志賀菌 無(wú)色細(xì)小 上紅下黃 半透明菌落 傷寒沙門(mén)菌 無(wú)色細(xì)小 上紅下黃 半透明菌落 黑色沉淀,檢測(cè)試劑的成分,病人體內(nèi)的反應(yīng),傷寒或副傷寒病人,O抗原 H抗原,含有 傷寒沙門(mén)菌O抗原 傷寒沙門(mén)菌H抗原 甲型副傷寒沙門(mén)菌H抗原 乙型副傷寒沙門(mén)菌H抗原,肥達(dá)試驗(yàn)（Widal test）,材料,傷寒沙門(mén)菌O、H菌液，甲型副傷寒沙門(mén)菌H菌液和乙型副傷寒沙門(mén)菌H菌液。 生理鹽水和患者血清（1:20稀釋?zhuān)⒘糠磻?yīng)板，1ml吸管，52水浴箱,方法,取46孔反應(yīng)板，孔橫向4排，縱列6列，依次編號(hào)。 于第2、3、4、5、6列每孔內(nèi)加入生理鹽水0.2ml。 于第1、2列在每孔內(nèi)加入稀釋度為1：20的受檢血清0.2ml ，從第2列開(kāi)始進(jìn)行倍比稀釋。 每排加入診斷菌液0.2ml 輕輕振蕩混勻后，水浴箱孵育2小時(shí),棄去0.2ml,效價(jià)的判定,結(jié)果觀察,+ 清澈透明，菌體形成凝塊于管底 + 較透明，大部分菌體形成凝塊于管底 + 稍渾濁，較多細(xì)小凝集 + 較渾濁，有細(xì)小凝集 渾濁，無(wú)凝集 血清凝集效價(jià)： (抗體滴度) 與定量Ag產(chǎn)生明顯凝集（+）的血清最高稀釋倍數(shù),參考值 傷寒桿菌凝集價(jià)H1：160，O1：80； 副傷寒凝集價(jià)A1：80，B1：80， C1：80,臨床意義機(jī)體感染傷寒、副傷寒桿菌后會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)抗體，正常人因隱性感染或預(yù)防接種，血清中可含有一定量的抗體。一般當(dāng)H1：160，O1：80，副傷寒凝集價(jià)1：80時(shí)，才有診斷意義。病程中應(yīng)每周復(fù)查一次，如病人H與O的凝集價(jià)均高于參考值或較原凝集價(jià)升高4倍以上，則患傷寒的可能性很大。若H凝集價(jià)高而O低于正常值，則可能是以往預(yù)防接種疫苗的結(jié)果或非特異性回憶反應(yīng)所致。,O抗原 沙門(mén)菌屬間有交叉反應(yīng) IgM H抗原 種特異性 - 傷寒沙門(mén)菌 IgG 甲型副傷寒沙門(mén)菌 乙型副傷寒沙門(mén)菌,結(jié)果分析,O與H抗體的診斷意義,O抗體：IgM H抗體：IgG,一般認(rèn)為O抗體效價(jià)在1：80以上，H抗體效價(jià)在1：160以上，有輔助診斷意義。但在分析結(jié)果時(shí)，應(yīng)注意以下兩點(diǎn)： （1）非腸熱癥患者，由于曾接種過(guò)傷寒，副傷寒疫苗或以往在流行區(qū)有過(guò)隱性感染或患過(guò)傷寒，副傷寒，以及回憶反應(yīng)等原因，也可呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。不過(guò)，由這些原因所引起的陽(yáng)性反應(yīng)主要是H抗體升高，O抗體效價(jià)一般不高，同時(shí)，每隔57天試血一次，其抗體效價(jià)一般不會(huì)隨病程而升高。